A. 请叙述细胞化学法在细胞内脂类的显示实验中的应用
1. 金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的
物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS 或PbS
有色沉淀，而显示出酶活性。
2. 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。
3. Schiff 反应：细胞中的醛基可使Schiff 试剂中的无色品红变为红色。这种反应通
常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen 反应）。
4. 联苯胺反应：过氧化氢酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化
成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。
5. 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。
6. Formazane 反应：显示脱氢酶。
7. “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。
8. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。
9. 茚三酮反应：显示蛋白质。
B. 细胞通透性实验中，10%氯化钠、0.32M甘油、0.32M乙醇、0.32M丙醇试剂一般都是怎么配制的
10%氯化钠应该是在450mL蒸馏水中溶解50g NaCl，即配制成500g的10%氯化钠溶液；
0.32M甘油：0.50L×0.32mol/L×92g/mol÷1.26g/mL = 11.7mL，量取11.7mL甘油转移到500mL的容量瓶中，用蒸馏水加到刻度线，盖上塞子，上、下倒置振荡几次即成500mL溶液；
0.32M乙醇：0.50L×0.32mol/L×46g/mol÷0.79g/mL = 9.3 mL，量取9.3mL无水乙醇转移到500mL的容量瓶中，用蒸馏水加到刻度线，盖上塞子，上、下倒置振荡几次即成500mL溶液；
0.32M丙醇：0.50L×0.32mol/L×60g/mol÷0.80g/mL = 12 mL，量取12mL丙醇转移到500mL的容量瓶中,用蒸馏水加到刻度线，盖上塞子，上、下倒置振荡几次即成500mL溶液；
你如果不是配制500mL溶液，可按此比例计算用量，然后再进行配制。
C. 如何做好免疫细胞化学实验
载玻片/盖玻片处理
聚醚酰亚胺或多聚赖氨酸在室温下包被盖玻片1小时。
无菌水冲洗盖玻片（3次 ，每次5分钟）。
可将盖玻片干完全干燥，并在紫外光下消毒至少4小时。
在玻片上种植细胞，或准备细胞离心涂片器，或做好涂抹准备。
磷酸盐缓冲液（ PBS ）进行简短的冲洗。
第一步：细胞固定
用预冷的甲醇、丙酮（ 1-10分钟），或3-4 ％甲醛（PBS的pH值7.4）室温（或者-20 ℃)固定细胞片15分钟。
用预冷的PBS冲洗细胞片两次。透化：如果目的蛋白是胞内表达，透化细胞非常重要。注：丙酮固定标本不需要透化。
用含0.25% Triton X-100或100 μM 洋地黄皂苷 or 0.5% 皂苷的PBS室温孵育标本10分钟。Triton X - 100是目前最流行的通透剂，可提高抗体的渗透程度。但这不适合与膜相连抗原的使用，因为它会将膜破坏。
PBS清洗细胞片3次，每次5分钟。
第二步：封闭和孵育
PBST孵育细胞（1 ％牛血清白蛋白），室温30分钟，以封闭抗体非特异性结合位点（封闭液也可以是1 ％明胶或10 ％的血清，此血清需来自二抗产生的物种体内） 。
加入一抗在湿盒内孵育细胞片（在使用含1% BSA PBST稀释抗体的），室温1小时或4 ℃过夜。
缓慢倒出溶液，PBS清洗细胞片的3次，每次5分钟。
加入含1 ％BSA的二抗稀释液，室温避光孵育1小时（避光）。
缓慢倒出二抗溶液，PBS清洗3次，每次5分钟（避光）。
第三步：复染
在0.1-1 μg/ml Hoechst or DAPI (DNA染液)下孵育细胞1分钟。
PBS清洗。
第四步：封片和观察
滴加一滴封片剂封片剂质，盖上盖玻片。
用指甲油密封盖玻片，以防止干燥和显微镜观察时移动。
观察后的细胞片可避光保存在-20或4°C。
D. 检测生物组织中的油脂的实验是否观察到位于两个细胞之间的脂肪滴，如何解释
位于两个细胞之间的脂肪滴可能是在制作切片时细胞破碎,细胞中的脂肪滴改变了位置.
E. 在做观察细胞中油脂的实验时,加入酒精有何作用
首先，酒精能改变细胞膜的通透性，其次，酒精能让细胞更好的与颜料结合，使细胞更好观察
F. 只能用甲醇溶的药物怎么做细胞实验
做细胞实验，浓度都是nmol到μmol级别的，通常我们都用DMSO溶解成1000倍的母液，然后加在细胞培养液里。
G. 为什么使用a549细胞做毒性实验
为什么使用a549细胞做毒性实验
1、培养A549细胞，了解A549细胞的倍增周期，扩增A549细胞；2、收集A549细胞并计数，按照一定的密度如2500细胞/孔，25uL/孔(参考值，需进行优化)进行铺板；3、在细胞板内培养一定时间，如24h等，该时间需要根据具体实验和铺板密度来确定，并且需要优化，至少要等到细胞贴壁之后才可以进行下一步；4、配制ABCD化合物溶液，通常将化合物溶解在DMSO中。由于细胞对DMSO敏感，因此在进行正式实验之前需要对实验体系进行DMSO耐受测试，获得A549在该实验体系中的最大DMSO耐受量。假设A549能够耐受1%的DMSO，那么需要配制100×终浓度的ABCD化合物溶液，并用培养基稀释到终浓度。5、弃掉细胞培养板中的培养液，将配好的化合物溶液转移到细胞培养板中，进行加药处理；6、培养一段时间，例如24h，48h等(该时间需要进行优化)，取出细胞培养板，向其中加入PromegaCaspase3/7Glo检测试剂，震荡10分钟后用酶标仪读板。7、将获得的数值与阴性对照、阳性对照进行比较并转换成作用百分比，即可判断该化合物是否有效。如果化合物配制时是配制的梯度溶液，还能获得活性化合物的IC50.
H. 检测生物体内糖类,脂肪,蛋白质 所有实验步骤和注意事项,
一．实验目的：尝试用化学试剂检测生物组织中糖类、脂肪和蛋白质
二．实验原理：某些化学试剂能使生物组织中的有关有机化合物,产生特定的颜色反应.
1．可溶性还原糖（如葡萄糖、果糖、麦芽糖）与斐林试剂发生作用,可生成砖红色的Cu 2O沉淀.即Cu ( OH ) 2被还原成Cu 2O,葡萄糖被氧化成葡萄糖酸.
2．脂肪可以被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色（或被苏丹Ⅳ染液染成红色）.
3．蛋白质与双缩脲试剂发生作用,产生紫色反应.（蛋白质分子中含有很多肽键,在碱性NaOH溶液中能与双缩脲试剂中的Cu2+作用,产生紫色反应.）
4.淀粉遇碘变蓝色.
三．实验材料
1．做可溶性还原性糖鉴定实验,应选含糖高,颜色为白色的植物组织,如苹果、梨.（因为组织的颜色较浅,易于观察.）
2．做脂肪的鉴定实验.应选富含脂肪的种子,以花生种子为最好,实验前一般要浸泡3-4小时（也可用蓖麻种子）.
3．做蛋白质的鉴定实验,可用富含蛋白质的黄豆或鸡蛋清.
四、实验试剂
斐林试剂（包括甲液：质量浓度为0.1g/ mL NaOH溶液和乙液：质量浓度为0.05g/ mL CuSO4溶液）、苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染液、双缩脲试剂（包括A液：质量浓度为0.1g/ mL NaOH溶液和B液：质量浓度为0.01g/ mL CuSO4溶液）、体积分数为50%的酒精溶液,碘液、蒸馏水.
五、方法步骤：
（一） 可溶性糖的鉴定
操 作 方 法
注 意 问 题
解 释
1.制备组织样液.
（≠组织液、≠细胞液）
苹果或梨组织液必须临时制备
因苹果多酚氧化酶含量高,组织液很易被氧化成褐色,
将产生的颜色掩盖.
2.注入2mL组织样液.
3.注入1mL新制的斐林试剂,振荡.
（现配现用、先混后加）
应将组成斐林试剂的甲液、乙液分别配制、储存,使用前才将甲、
乙液等量混匀成斐林试剂；切勿将甲液、乙液分别加入苹果组织样液中进行检测.
斐林试剂很不稳定,甲、乙液混合保存时,生成的Cu ( OH ) 2在70-900C下分解成黑色CuO和水；甲、乙液分别加入时可能会与组织样液发生反应,无
Cu ( OH ) 2生成.
4.水浴加热：试管放在盛有50-650C温水的大烧杯中,加热约2分钟,观察到溶液颜色：浅蓝色 → 棕色 → 砖红色（沉淀）
最好用试管夹夹住试管上部,使试管底部不触及烧杯底部,试管口不朝向实验者.
也可用酒精灯对试管直接加热.
防止试管内的溶液冲出试管,造成烫伤；
缩短实验时间.
（二）脂肪的鉴定
操 作 方 法
注 意 问 题
解 释
取材、切片、制片：花生种子浸泡、去皮、切下一些子叶薄片,将薄片放在载玻片的水滴中,用吸水纸吸去装片中的水.
干种子要浸泡3-4小时,新花生的浸泡时间可缩短.
浸泡时间短,不易切片,浸泡时间过长,组织较软,切下的薄片不易成形.切片要尽可能薄些,便于观察.
染色：在子叶薄片上滴2-3滴苏丹Ⅲ（染色3分钟）或苏丹Ⅳ染液（染色1分钟）.
染色时间不宜过长.
漂洗：用吸水纸吸去薄片周围染液,用50%酒精洗去浮色,吸去酒精.
酒精用于洗去浮色,不洗去浮色,会影响对橘黄色脂肪滴的观察.同时,酒精是脂溶性溶剂,可将花生细胞中的脂肪颗粒溶解成油滴.
用吸水纸吸去薄片周围酒精,滴上1-2滴蒸馏水,盖上盖玻片.
滴上清水可防止盖盖玻片时产生气泡.
镜检：先低后高（高倍镜用法：移物换器时针反）,低倍镜下找到花生子叶薄片的最薄处,可看到细胞中有染成橘黄色或红色圆形小颗粒.
装片不宜久放.
时间一长,油滴会溶解在乙醇中.
三、蛋白质的鉴定
操 作 方 法
注 意 问 题
解 释
制备组织样液.
（浸泡、去皮研磨、过滤.）
黄豆浸泡1至2天,容易研磨成浆,
也可购新鲜豆浆以节约实验时间.
加样液约2ml于试管中,
加入双缩脲试剂A,摇匀；再加入双缩脲试剂B液3-4滴,摇匀,溶液变紫色.
A液和B液也要分开配制,储存.鉴定时先加A液后加B液.
CuSO4溶液不能多加.
先加NaOH溶液,为Cu2+与蛋白质反应提
供一个碱性的环境.A、B液混装或同时加入,会导致Cu2+变成Cu ( OH ) 2沉淀,而失效.
否则CuSO4蓝色会遮盖反应的真实颜色.
可用蛋清代替豆浆.
蛋清要先稀释.
如果稀释不够,在实验中蛋清粘在试管壁,与双缩脲试剂反应后会粘固在试管内
壁上,使反应不容易彻底,并且试管也不易洗干净.
附：淀粉的检测和观察用试管取2ml待测组织样液,向试管内滴加2滴碘液,观察颜色变化.
碘液不要滴太多
以免影响颜色观察
I. 有哪位高手能详细指导一下用transwell板做细胞趋化实验的具体方法和步骤吗
1 材料与方法
1. 1
Matrigel：Becton Dickinson Compary, - 20 ℃保存；
Tanswell plate：Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直径为8μm；
苏木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。
1. 2 趋化因子的制备 取传代第二天长势良好的NIH3T3细胞,无血清培养基轻柔漂洗两次; 加入无血清培养基,37℃,5 %CO2 培养24 h～48h，收集细胞培养上清；4 ℃,12 000rpm 离心,10 min ,取上清；0.22 μm 滤膜过滤除菌；分装,在- 20 ℃保存。
1. 3
transwell 培养板准备 所有操作均需无菌操作。-20℃保存的Matrigel 在冰上保2℃～8℃过夜融化。在冰上用预冷的枪头吸取100μl Matrigel 加入冰预冷的300μl 无血清培养基中,充分混均。取上述稀释的Matrigel 25 μl 加入transwell 板上室,覆盖整个聚碳酯膜,37 ℃,30 min ,使Matrigel 聚合成胶。已铺好Matrigel的transwell 培养板置于37℃可保存2 周。
1. 4
Matrigel 侵袭实验(Matrigel Invasion Assay)刺激后的各组细胞用PBS 漂洗3 次。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液,5 ×105个细胞/ ml ,每组细胞各分为两部分。胎盘兰拒染实验,细胞活力需大于95 %。Transwell 培养板上室加入100μl 细胞悬液( 5 ×104 个) 并加入无血清培养基200 ul 。Transwell 培养板下室加入500μl 趋化因子,37℃,5 %CO2 培养24 h。用湿棉签轻轻擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。小心取出上室,用线拴住,并做好标记,用冰预冷的甲醇固定30 min。苏木素染色1 min。梯度乙醇脱水(80 % ,95 % ,100 %) ,二甲苯透明。小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下( ×400) 随机取6 个视野[1 ] 计数,取平均数。重复实验两次。
注意 2. 1
NIH3T3 细胞制备的趋化因子与胎牛血清 趋化因子是能使细胞产生趋化运动的一类细胞因子[2 ] 。目前利用NIH3T3 细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验的实验室比较多,时间较长且实验步骤繁琐。众所周知,胎牛血清中有趋化因子,我们在不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验中发现用胎牛血清和用NIH3T3 细胞制备的趋化因子做细胞体外侵袭实验效果是一样的,两组迁移的细胞数很接近。在实验时间上，用NIH3 T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为1 周,而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭实验周期为2 d ,实验时间节省了很多。因此认为可以用胎牛血清来代替NIH3T3 细胞制备的趋化因子。
2. 2 细胞的准备 所需细胞应处在对数生长期,细胞活力需大于95 %。如果细胞活力小,就会造成细胞穿透能力下降,影响实验结果。
2. 3 擦去Matrigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞 先用干棉签将上室内液体吸去,再用蒸馏水浸湿的棉签轻轻擦去Mat rigel 凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞,如果没有擦净聚碳酯膜上表面的细胞,在细胞计数时就会将没擦掉的细胞也计进来。尤其是细胞为圆形的时候,就会分辨不出是穿过去的细胞还是没穿过去的细胞,对于长梭形细胞来说,穿过去的细胞为长梭形,没穿过去的细胞多为圆形。
2. 4 苏木素染色 上室浸泡在新苏木素中的时间为1 min ,用过多次的苏木素为2 min。在研究粉防己碱对HUVEC 人类脐静脉内皮细胞迁移能力的抑制作用没有将多余苏木素洗去,直接脱水、透明,造成细胞图片背景模糊,细胞不清楚(见图1) 。在作不同浓度TNFα刺激下的HCCC29810 胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱实验时我们将其置于盛有自来水的烧杯中,反复漂洗几次,将多余苏木素洗去再行脱水、透明;这样做出的细胞图片背景干净,细胞清楚(见图2) 。
J. 总结细胞内化合物的鉴定原理和现象
蛋白质 蛋白质+双缩脲试剂→紫色结合物 溶液变紫
脂类 脂质小颗粒+苏丹Ⅲ染液→橘黄色小颗粒 溶液变黄
糖类 可溶性还原糖+斐林试剂→砖红色沉淀 生成砖红色沉淀
核酸 核酸分子因含磷酸根呈酸性,它们对碱性染料甲基绿和派洛宁具有亲和力
DNA+甲基绿→绿色
RNA+派洛宁→红色