1. 蚕丝蛋白水解液怎样制备越详细越好,非常谢谢!
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 原辅材料
蚕丝、葛根、枳枸子、乌梅均购于徐州市场。蔗糖、中性蛋白酶(130000 u/g)、胰蛋白酶(4000 u/g)由实验室提供,木瓜蛋白酶(650000 u/g)由广西海发生物酶制品厂提供。
1.1.2 主要试剂
甲醛试剂、浓硫酸、浓盐酸、氢氧化钠、无水硫酸钠、无水氯化钙、氯水、邻二甲酸氢钾、甲基红、硫酸铜、硼酸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、食盐、731及723阴阳离子交换树脂和混合提示剂:1体积的亚甲基蓝和 2体积的甲基红指示剂的混合物。
1.1.3 主要设备
电热恒温干燥箱、电热恒温培养箱、多功能粉碎机、低速大量离心机、架盘天平、磁力搅拌器、精密pH计、电子天平、数显恒温水浴锅、手提式压力蒸汽灭菌锅、电磁炉。
1.2 实验方法
1.2.1 工艺流程
(1)采用酸解液调配饮料的工艺流程
蚕丝脱胶→酸解→阳离子交换树脂脱酸→丝素氨基酸
中草药→清洗→浸提→粗滤→离心 调配→
香精、VC、蔗糖等
灌装→封口→杀菌→冷却→感官鉴评及卫生检测→成品
(2)采用酶解液调配饮料的工艺流程
蚕丝脱胶→CaCl2溶解丝素→酶解→灭酶→去CaCl2→丝素氨基酸
中草药→清洗→浸提→粗滤→离心→调配→灌装
香精、VC、蔗糖等
→封口→杀菌→冷却→感官鉴评及卫生检测→成品
1.2.2 蚕丝脱胶的方法
将洗净烘干后的蚕丝在Na2CO3溶液(0.4%,0.5%,0.6%)煮沸处理(20min,30min,40min),确定最佳脱胶条件。
1.2.3 丝素酸解的方法
将脱胶后的丝素烘干做单因素实验。先选酸度为3M,固液比1∶50,111℃下酸解15h,测定每小时的氨基酸含量,可得到酸解时间的适宜范围;再选定固液比1∶50,酸解时间在以上确定范围内,110℃下采取1.0M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M、3.5M、4.0M、4.5M、5.0M等不同浓度酸解,可选出适宜的酸浓度范围;最后选定酸浓度与时间在适宜范围内,通过选定不同固液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80,确定最适宜固液比范围。将得到的酸浓度、固液比、酸解时间分别在适范围内选3个水平做3因素3水平的正交实验,由此来找出最佳酸解条件。
1.2.4 丝素在CaCl2中的溶解
配制不同浓度(30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、)的CaCl2溶液,测定丝素在其中的溶解效果,找出溶解丝素的CaCl2最佳浓度。
1.2.5 酶解工艺的研究方法 (1)最佳水解酶选择。使蚕丝蛋白液在3种蛋白酶的最适加酶量、酶解温度、酶解pH值及相同酶解时间下进行酶解,比较3种酶的酶解效果,根据氨基酸得率选出水解效果最好的酶。(2)酶解条件确定。根据以上实验所确定的最佳丝素蛋白酶,分别对底物浓度,pH值、温度确定3个水平做正交实验,以此来确定酶解最佳条件。底物浓度分别为4%、5%、6%,pH值分别为5.0,5.5、6.0,酶解温度分别为50℃、55℃、60℃。
1.2.6 酸解液脱酸
采用732型强酸型阳离子交换树脂对酸解液进行脱酸,待流出液使茚三酮呈紫色反应时,停止上柱,用去离子水洗涤离子交换柱,至流出液近中性,再用0.5M氨水洗脱氨基酸,至不使茚三酮显紫色为止。
1.2.7 中草药汁的提取
将洗净的中草药与纯净水按1∶10的比例在90℃水浴锅中浸提1h,得到虑液,再在残渣中加入8倍量的纯净水于90℃水浴中浸提0.5h,把滤液与残渣液合并后经低速大容量离心机离心后备用。
1.2.8 饮料的调配
设计1个3因素3水平的正交试验来选择饮料的配方。为了对饮料进行评分,需按制品的色泽、香气、滋味和组织状态确定一个评分标准。
1.2.9 饮料杀菌及卫生检测
饮料杀菌:将成品分别在90℃下杀菌15min、20min、25min,然后置于37℃恒温水浴培养箱中观察其稳定性,选择最佳杀菌时间。细菌总数的测定采用平板菌落计数法。
1.3 检测项目及方法
蚕丝中粗蛋白的测定用微量凯氏定氮法。氨基氮含量的测定用甲醛电位法。
1.3.1 丝素酶解液脱酸效果的检验
采用732型强酸型阳离子交换树脂,放入高40cm,Φ15的树脂柱中,待流出液使茚三酮呈紫色,说明树脂已饱和,氨基酸液流出,此时停止上柱,用去离子水洗涤离子交换柱,至流出液近中性,再用0.5M氨水洗脱氨基酸,至不使茚三酮呈色反应,说明氨基酸已脱尽。
1.3.2 阴阳离子交换树脂去离子效果的检测
将用CaCl2溶液溶解后的丝素蛋白液选经过柱高40cm,Φ15的阳离子交换树脂柱去Ca2+,用NaOH溶液检测流出液中有无Ca2+,当无白色沉淀出现时,再经过柱高40cm,Φ15的阴离子交换树脂去除Cl-,用AgNO3检测流出液中有无Cl-,当无白色沉淀出现时停止上柱。
2 结果与讨论
2.1 蚕丝脱胶条件的确定
蚕丝中次要成分主要分布在丝胶蛋白中,为保证丝素氨基酸的质量,必须进行脱胶。丝素不溶于水,而丝胶是水溶性的。尽管丝胶有亲水性,但要在水介质中将它与丝素分离开来需很长时间,且要高温处理,为此采用Na2CO3作分离介质。其中丝胶蛋白脱去率(%)=丝胶液中蛋白质含量(g)×100%丝胶蛋白总量(g)。试验结果如表1。
表1 Na2CO3解脱丝素蛋白正交实验设计方案及结果
处理 时间(min) 浓度(%) 丝胶脱去率(%)
1 1(20) 1(0.4) 48.5
2 1 2(0.5) 35.7
3 1 3(0.6) 59.8
4 2(30) 1 60.3
5 2 2 100
6 2 3 100
7 3(40) 1 73.9
8 3 2 100
9 3 3 100
由表1可以看出,在0.5%NaCO3溶液中中煮沸30min脱胶效好最好。在煮沸时为防止水分蒸分,影响NaCO3浓度,需在容器上加盖子。蚕丝脱胶后即为丝素蛋白,丝胶蛋白存在于水介质中。
2.2 酸解单因子实验
用1g丝素在3M H2SO4,固液比1∶60,110℃下水解。从实验中发现丝素在H2SO4中3h才能完全溶解。测定4~15h的水解情况可知,氨基酸在8~10h含量较高,10h后变化很小,甚至开始减小。
用丝素在固液比1∶60,110℃下酸解8h,比较不同H2SO4浓度与氨基氮含量的关系,结果酸解浓度太低或太高都会影响氨基酸含量,控制在3M~4M较好。
用丝素在3M H2SO4,110℃下酸解8h,测固液比对酸解的影响,由于丝素至少1∶20的固液比才能浸泡,以此为最小固液比。结果固液比在1∶50~1∶70时水解效果最好。
2.3 酸解正交试验
从酸解单因素实验中得知影响酸解的因素主要是酸浓度、固液比、时间,由此选定各因素的3个水平,实验结果如表2。
表2 酸解正交试验结果与分析
所在列 A B C
因素 时间(h) 酸渡度(M) 固液化 氨基酸得率(%)
实验1 1(8) 1(3) 1(1∶50) 69.1
实验2 2(9) 2(3.5) 2(1∶60) 73.2
实验3 3(10) 3(4) 3(1∶70) 71.9
实验4 2 1 2 87.2
实验5 2 2 3 89.1
实验6 2 3 1 86.5
实验7 3 1 3 78.4
实验8 3 2 1 80.3
实验9 3 3 2 79.6
均值1 71.400 78.233 78.633
均值2 87.600 80.867 80.000
均值3 79.433 79.333 79.800
极差 16.200 2.634 1.367
由表2得酸解得率最高组合为A2B2C3,但从表4中得理想组合为A2B2C2,所以再做A2B2C2对照,结果测得丝素氨基酸得率为89.8%,比A2B2C3稍好,所以确定酸解最佳条件为酸浓度为3.5M,固液比1∶60,110℃下酸解9h。
2.4 CaCl2溶解丝素结果
丝素在CaCl2溶液中的溶解特性较为特别,浓度低于35%或高55%时几乎不溶解,如表3,以40%为最佳。
表3 CaCl2浓度与丝素溶解关系
1 2 3 4 5 6 7 8
CaCl2浓度 30% 35% 40% 45% 50% 55% 60% 65%
丝素溶解度 0 14.5% 100% 32.5% 15.5% 0 0 0
2.5 最佳水解酶确定
木瓜蛋白酶pH控制在6.0,温度为50℃,E/S=10%,底物浓度即丝素蛋白浓度为4%,进行酶 解。实验表明:前1h酶解速度增加很快,3h达到0.07mg/ml,以后增加缓慢。胰蛋白酶在pH8.0,温度40℃,E/S=2%,丝素蛋白浓度为4%下进行酶解。7h达到最大值0.053mg/ml。中性蛋白酶在pH7.0,温度50℃,E/S=2%,丝素蛋白浓度为4%下酶解,3h达到0.065mg/ml。由此可知,木瓜蛋白酶水解效果最好。
2.6 木瓜蛋白酶水解丝素蛋白正交实验
做正交试验确定木瓜蛋白酶水解丝素蛋白的最佳条件组合。木瓜蛋白酶最佳酶解条件为pH5.5,温度55℃,底物浓度为5%,加酶量为10%。最终1.001g丝素蛋白可得0.184g氨基酸。从丝素的酸解、酶解比较得出,酸解明显比酶解好。
2.7 饮料调配
饮料的制作应注意风味的调整,影响本饮品风味的主要因素为氨基酸浓度、中草药浓度、糖浓度,因此设计1个3因素3水平的正交试验来优选饮料的配方。如表4。
表4 饮料调配结果与分析
所在列 A B C
因素 氨基酸 中草药 糖浓度(%) 实验结果
浓度(%) 浓度(%)
实验1 1(0.3) 1(2) 1(8) 7.8
实验2 1 2(3) 2(9) 7.4
实验3 1 3(4) 3(10) 7.2
实验4 2(0.4) 1 2 9
实验5 2 2 3 8.5
实验6 2 3 1 8
实验7 3(0.5) 1 3 7.6
实验8 3 2 1 7
实验9 3 3 2 7.5
均值1 7.467 8.133 7.600
均值2 8.500 7.633 7.967
均值3 7.367 7.567 7.767
极差 1.133 0.566 0.367
由表4可得饮品的最佳调配配方:氨基酸浓度为0.4%,中草药汁浓度为2%,糖浓度为9%,再加少量水蜜桃香精及VC即得成品。
2.8 饮品的贮藏稳定性试验
本试验在装罐前、后都进行杀菌,且对中草药汁进行离心,故得到的饮品澄清透明。在装罐后通过不同杀菌时间,观察其稳定性。分别在90℃条件下杀菌15min、20min、25min,冷却后置于37℃恒温培养箱内观察。9d后均无变化,仍是澄清透明的黄褐色溶液。
为了确定最佳杀菌时间,将保藏9d后的成品做细菌检测实验,结果是90℃杀菌25min细菌总数为56个/ml,满足国标要求。
3 产品质量标准
3.1 感官指标
色泽:黄褐色,均匀一致。风味:酸甜可口,有轻微的丝素氨基酸和中草药的苦涩味,无异味。组织形状:汁液透明,无杂质,久置后也无沉淀出现。
3.2 理化指标
酸度:pH3.5~4.0,总菌数≤100个/ml,大肠菌数≤3个/ml,致病菌不得检出。
4 结论
丝素酸解比酶解的氨基酸得率高,酸解得率达89.1%,而酶解只有18.1%。由于酸解比酶解操作简便且水解液色泽、气味均较好,所以在制作饮料时采用酸解液。确定的最佳脱胶条件为0.5%的Na2CO3煮沸处理30min,在此条件下丝胶全部脱除且丝素没有损失。脱胶后丝素经洗涤烘干处理后进行酸解,得到酸解最佳工艺条件为3.5MH2SO4,固液比1∶60,110℃下水解9h,氨基酸得率高达89.8%。将阳离子交换树脂脱酸的氨基酸溶液与中草药进行调配,得到饮料的最佳调配方案为丝素氨基酸浓度0.4%,中草药浓度2%,糖浓度9%,VC浓度0.2%。由此制得澄清透澈、酸甜可口的黄褐色饮品。
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