① 胶原蛋白的生物学性状
胶原作为医用生物材料,最重要的特点在于其低免疫原性,与其它具有免疫原性的蛋白质相比,胶原蛋白的免疫原性非常低。人们甚至曾认为胶原不具有抗原性,研究表明:胶原具有低免疫原性,不含端肽时免疫原性尤其低。胶原有三种类型的抗原分子,第一类是胶原肽链非螺旋的端肽,在天然和变性胶原中均存在。由于2个不同种类的哺乳动物中间的胶原蛋白,其整个氨基酸序列变化不是很大,而且胶原蛋白的三螺旋区域有高度的进化稳定性,但在非螺旋的末端区域中有很大的变化性,在这区域中几乎50%以上的氨基酸残基表现出种属性变化,大量的研究和生产都集中在如何完全去除端肽,只要去除端肽就认为是安全的。第二类是胶原的三股螺旋的构象,仅存在于天然胶原分子中,即位于天然胶原蛋白的三螺旋结构中的抗原决定簇,会在分离和纯化过程中暴露出来,尤其是含α1和α2单链暴露出的中央端情况下更为明显。第三类是α-链螺旋区的氨基酸顺序,只出现在变性胶原中。
免疫学分析和研究结果表明,使用胶原加完全弗氏佐剂,能对胶原产生多克隆和单克隆抗体。由T细胞启动的对胶原蛋白免疫反应的证据是,位于重要组织相容性(H-2)部位上ⅠA或ⅠB亚区的免疫反应基因已被鉴定。胶原蛋白免疫原性的临床评价通常是皮肤过敏性测试(细胞免疫指数,迟发性Ⅳ型反应)和由反应型抗体的存在(体液免疫指数)来确定的。实践证明,在患者身上进行这两种评价是合理的。在治疗前,用过敏剂量的植入性胶原对患者进行皮试,大约3%有潜在的反应,反复多次处理的患者,大约1%~2%会产生迟发性过敏性的临床病状,典型的症状包括局部水肿和红斑反应,有的还伴有硬化和瘙痒,持续时间4~6个月,个别甚至可达1年以上。 胶原蛋白是肌体自然蛋白,对皮肤表面的蛋白质分子具有较大的亲和力、较弱的抗原性、良好的生物相容性和生物降解安全性,可降解吸收,粘着力好。由胶原制成的手术缝合线既有与天然丝一样的高强度,又有可吸收性,在使用时既有优良的血小板凝聚性能,止血效果好,又有较好的平滑性和弹性,缝合结头不易松散,操作过程中不易损伤机体组织,对创面有很好的黏附性,一般情况下只需较短时间的压迫就可达到满意的止血效果。所以胶原蛋白可以制成粉状、扁状及海绵状的止血剂。同时用合成材料或胶原蛋白在血浆代用品、人造皮肤、人工血管、骨的修复和人工骨和固定化酶的载体等方面的研究和应用方面都十分的广泛。
胶原蛋白分子肽链上具有多种反应基团,如羟基、羧基和氨基等,易于吸收和结合多种酶和细胞,实现固定化,它具有与酶和细胞亲合性好、适应性强的特点。另外,胶原易加工成型,故纯化的胶原蛋白可制成许多不同形式的材料,如膜,带,薄片,海绵,珠体等,但以膜形式应用的报道最多。胶原制备膜用于生物医学,除具有生物可降解性、组织可吸收性、生物相容性、弱抗原性外,还主要有:亲水性强,抗张强度高,具有类似真皮的形态结构,透水透气性好;高抗张强度和低延展性决定的生物塑性;官能团多,可进行适度交联改性,从而可控制其生物降解速度;可调节溶解(溶胀)性;与其它生物活性组分一起使用,具有协同效应;可与药物相互作用;交联或酶处理去端肽可使抗原性降低,可隔离微生物,有生理活性,如有血凝作用等优点。同时也存在以下缺点:胶原的分离纯化及加工处理复杂,分离的胶原交联密度、纤维大小等具有多样性。酶解胶原速度多变,条件难于控制;且纯胶原干燥后质地脆,成膜能力并不强,其膜延展性低,易干裂,抗水性差,遇水易溶胀,在体内易降解,潮湿环境中易受细菌侵蚀而变质,此外还可能导致一些副反应,如组织钙化等。故实际应用中,常常通过一定方法将胶原蛋白改性,通过改性避免胶原蛋白制备材料的缺点,提高胶原的拉伸强度及抗降解能力,降低膨胀率,改善胶原的力学性能与抗水性。
临床应用形式有水溶液、凝胶、颗粒剂、海绵和薄膜等。同样这些形状都可用于药物缓释,已获准上市和正在研发的胶原蛋白药物缓释应用大都集中在眼科中抗感染和青光眼治疗,创伤中的局部治疗及伤口修复的控制感染,妇科的宫颈发育异常和外科的局部麻醉等。 由于胶原蛋白广布于人体各组织中,系各组织中的重要成分并构成组织细胞外基质(Extracelluarmatrix,ECM),其性质是一种天然的组织支架材料。从临床应用的角度,人们用胶原蛋白制成各种各样的组织工程支架,如皮肤、骨组织、气管和血管支架等。然而以胶原本身而言就有两大类,即纯胶原制备的支架和与其它成分复合而成的复合物支架。纯胶原蛋白组织工程支架具有生物相容性好、易加工、可塑性并能促进细胞黏附、增殖等优点,但也有胶原蛋白的力学性能差,在含水时难以塑形,无法支撑组织重建等不足。其次在修复处的新生组织会产生各种各样的酶,将胶原蛋白水解,导致支架崩解,而采用交联或复合的方式能改善与提高。现已成功地将胶原蛋白基生物材料用于人工皮肤、人工骨、软骨移植和神经导管等组织工程产品。有人用嵌入软骨细胞的胶原蛋白凝胶来修复软骨缺陷并尝试用上皮、内皮和角膜细胞附在胶原蛋白海绵以适应角膜组织。还有人混合自体同源的间叶细胞中的茎状细胞和胶原蛋白凝胶制作肌腱用于腱后修复。
以胶原蛋白为基质作真皮辅以上皮成分构成的组织工程人工皮肤药物缓释胶以胶原蛋白为主要成分的给药系统应用非常广泛,可以把胶原蛋白水溶液塑造成各种形式的给药系统,如眼科方面的胶原蛋白保护物、烧伤或创伤使用的胶原海绵、蛋白质传输的微粒、胶原蛋白的凝胶形式、透过皮肤给药的调控材料以及基因传输的纳米微粒等。此外,还可作为组织工程包括细胞培养系统的基质、人工血管和瓣膜的支架材料等。 胶原蛋白由动物皮提取,皮中除胶原蛋白外还含有透明质酸、硫酸软骨素等蛋白多糖,它们含有大量极性基团,是保湿因子,且有阻止皮肤中的酪氨酸转化为黑色素的作用,故胶原蛋白有纯天然保湿、美白、防皱、祛斑等作用,可广泛应用于美容用品中。胶原蛋白的化学组成、结构赋予了它是美容的基础。胶原蛋白与人体皮肤胶原的结构相似,为非水溶性纤维状含糖蛋白质,分子中富含大量氨基酸和亲水基,具有一定的表面活性和很好的相容性,同时由于其分子中含有大量的羟基,因此它有着相当好的保湿作用。在相对湿度70%时,仍可保持其自身重量45%的水分。试验证明:0.01%的胶原蛋白纯溶液就能形成很好的保水层,供给皮肤所需要的全部水分。
随着年龄的增长,成纤维细胞的合成能力下降,若皮肤中缺乏胶原蛋白,胶原纤维就会发生联固化,使细胞间粘多糖减少,皮肤便会失去柔软、弹性和光泽,发生老化,同时真皮的纤维断裂、脂肪萎缩、汗腺及皮脂腺分泌减少,使皮肤出现色斑、皱纹等一系列老化现象。将其作为活性物质用于化妆品中时,后者可以扩散到皮肤的深层,其含有的酪氨酸与皮肤中的酪氨酸竞争,而与酪氨酸酶的催化中心结合,从而抑制黑色素的产生,使皮肤中的胶原蛋白活性增强,保持角质层水分以及纤维结构的完整性,促进皮肤组织的新陈代谢,对皮肤产生良好的滋润保湿、消皱美容作用。早在20世纪70年代初,美国就率先推出注射用牛胶原,用于祛斑除皱纹及修复瘢痕。
不过在化妆品中,单纯用作营养性护肤类原料通常要求分子量在2KD以下,以让水解胶原能渗透入皮肤内。而护发类化妆品除要求水解胶原具有保湿性以外,还应具有一定的成膜性,因此,水解胶原的分子量要求会更高。 胶原蛋白亦可用于食品,早在十二世纪Bingen 的 St.Hilde-gard 就描述了利用小牛的软骨汤作为药物来治疗关节疼痛,在相当长的一段时间里,含胶原的一些产品被人们认为对关节是很有益处的。因为它具有适用于食品的一些属性:食用级通常外观为白色,口感柔和,味道清淡,易消化。可以降低血甘油三酯和胆固醇,并可以增高体内某些缺乏的必需微量元素使之维持在一个相对的正常范围之内,它是一种理想的降血脂食品。此外,有研究表明,胶原蛋白可以协助排除体内的铝,减少铝在体内的聚集,降低铝质对人体的危害,并一定程度上促进指甲和头发的生长。Ⅱ型胶原是关节软骨中的主要蛋白,因而是潜在的自身抗原。口服后能诱导T细胞产生免疫耐受,从而抑制T细胞介导的自身免疫性疾病。胶原多肽是胶原或明胶经蛋白酶等降解处理后制得的具有较高消化吸收性、分子量约为2000~30000的产物,不具有明胶的凝胶性能,市场上销售的胶原多为胶原多肽。
胶原的一些品质使得它在许多食品中用作功能物质和营养成分具有其它替代材料难以比拟的优点:胶原大分子的螺旋结构和存在结晶区使其具有一定的热稳定性;胶原天然的紧密的纤维结构使胶原材料显示出很强的韧性和强度,适用于薄膜材料的制备;由于胶原分子链上含有大量的亲水基团,所以与水结合的能力很强,这一性质使胶原在食品中可以用作填充剂和凝胶;胶原在酸性和碱性介质中膨胀,这一性质也应用于制备胶原基材料的处理工艺中。
胶原蛋白粉可直接加入到肉制品,以影响肉类的嫩度和肉类蒸煮后肌肉的纹理。研究表明,胶原蛋白对原料肉和烹饪肉质地的形成非常重要,胶原蛋白含量越高,肉的质地越硬。像鱼肉的嫩化被认为与V型胶原蛋白降解有关,其肽键的破坏引起的细胞外周胶原纤维的裂解被认为是肌肉嫩化现象的主要原因。通过破坏胶原蛋白分子内的氢键,使原有的紧密超螺旋结构破坏,形成分子较小、结构较为松散的明胶,既可改善肉质的嫩度又可提高其使用价值,使其具有良好的品质,增加蛋白质含量,既口感好又有营养。日本还开发出了动物胶原蛋白为原料经胶原蛋白水解酶水解、调制开发出新型调味品和清酒,不但有特殊的风味,还能补充部分氨基酸。
随着各类香肠制品在肉制品中所占的比例越来越大,天然的肠衣制品严重缺乏。研究人员正致力于替代品的开发,以胶原蛋白质为主要的胶原肠衣本身是营养丰富的高蛋白物质,在热处理过程中随着水分和油脂的蒸发与溶化,胶原几乎与肉食品的收缩率一致,而其他的可食用包装材料还没有被发现具有这种品质。另外,胶原蛋白本身具有固定化酶的功能,具有抗氧化性,可以改善食品的风味和质量。产品应力与胶原蛋白含量的多少成正比,而应变则成反比。 胶原蛋白是人体骨骼,尤其是软骨组织中的重要组成成分。胶原蛋白就像骨骼中的一张充满小洞的网,它会牢牢地留住就要流失的钙质。没有这张充满小洞的网,即便是补充了过量的钙,也会白白地流失掉。而胶原蛋白的特征氨基酸羟基脯氨酸是血浆中运输钙到骨细胞的工具。骨细胞中的骨胶原是羟基磷灰石的黏合剂,它与羟基磷灰石共同构成了骨骼的主体。而骨质疏松的实质是合成骨胶原的速度跟不上需要,换言之,新的骨胶原的生成速度低于老的骨胶原发生变异或老化速度。研究表明,如果缺少胶原蛋白,补充再多的钙质也无法防止骨质疏松,因此,只有摄入足够的可与钙结合的胶原蛋白,才能使钙在体内被较快消化吸收,且能较快的达到骨骼部位而沉积。
将胶原蛋白和聚乙烯吡咯烷酮溶在柠檬酸缓冲液里制得胶原蛋白-PVP聚合物(C-PVP),用于受伤骨骼的加固不仅效果好,安全性也高,即使长周期的连续用药,不管是实验还是临床试验都不表现出淋巴肿大、DNA损伤,不会引起肝和肾的代谢紊乱,也不诱发人体产生抗C- PVP的抗体。 饲料用胶原蛋白粉是以制革的残次皮料、皮边角余料等副产物为原料,运用物理、化学或生物技术方法处理得到的蛋白质产品。制革厂鞣革后匀削和剪裁产生的固体废弃物统称为鞣革废渣,其干物质的主要成分就是胶原蛋白。处理后可作为一种动物源性蛋白营养添加剂,替代或部分替代进口鱼粉,用于混、配合饲料的生产,具有较好的饲喂效果和经济效益。其蛋白质含量高,富含18种以上氨基酸,含有钙、磷、铁、锰、硒等矿物质元素,并带有芳香味。研究表明,水解胶原蛋白粉可部分或全部替代生长肥育猪日粮中的鱼粉或豆粕,但添加比例不能超过 6%,当含量达 8%时则显着降低生产性能及日粮消化率,增加饲养成本。
还有人进行了生长试验和消化试验以评价水产饲料中胶原蛋白替代鱼粉的效果。生长试验是在基础饲料(对照组,含鱼粉 12%)中分别以 2%、4%胶原蛋白等重量替代鱼粉饲养平均体重6.5g的异育银鲫(共 315 尾)35 d,各组鱼体增重率分别为 71.3%、70.9%、71.9%,各组间没有显着差异(P>0.05);消化试验是采用平均体重 110g 的异育银鲫,按套算法测定了异育银鲫对胶原蛋白的蛋白质消化率为 97.3%。研究结果表明,胶原蛋白具有很高的消化吸收率,可部分替代鱼粉而对异育银鲫的增重无影响。 有人研究了膳食铜缺乏与老鼠心脏胶原蛋白含量之间的关系。通过SDS- PAGE分析,再用考马斯亮蓝染色,结果表明检测改变了的胶原蛋白的额外代谢特征可预测铜缺乏;由于肝脏纤维化可减少蛋白质含量,因此还可通过测定肝脏中胶原蛋白的含量来预测肝脏纤维化。Anoectochilusformosanus的水提取物(AFE)则可降低CCl4诱发的肝脏纤维化,降低肝脏胶原蛋白的含量。胶原蛋白还是巩膜的主要成分,对眼睛的作用也非常重要,如果巩膜中胶原蛋白的合成减少而降解增加就会导致近视。
② 胶原是什么物质!
胶原是蛋白质的一种。人体中有10万种蛋白质,其中,胶原的量最多,它占人体蛋白质总量的30%左右。胶原是填补在细胞与细胞之间的成分(
细胞外基质
)的主要构成物。胶原的分子是像丝一样的构造,许多胶原蛋白分子集合在一起就形成
胶原纤维
,这些纤维支撑着人体的各种组织。此外,胶原还具有帮助
细胞增殖
的功能。
人体内的胶原大约有40%存在于皮肤内。骨骼和软骨中也含有许多胶原,它们约占全部胶原的20%。其余的胶原则存在于血管、肌腱以及各个脏器中。骨骼是矿物质(磷酸钙)沉积在胶原上形成的。维生素C是合成胶原必不可少的营养成分。如果维生素C极度缺乏,皮肤或黏膜就容易出血,从而引发
坏血病
,同时,骨骼也会变得脆弱。
胶原分子的分子量约30万,是三股螺旋形的链状结构。三股螺旋链在加热时散开变成单链,这样就成了有弹性口感的明胶,它是制造
肉皮冻
或果冻的原料。如果明胶再进一步分解,就成了分子量是几千的
胶原肽
,它是一些保健食品的原料。
③ 胶原与原胶原关系
胶原一般指的就是胶原蛋白,或则胶原纤维。
而原胶原是在胶原蛋白形成过程中,一个重要的基本结构,它主要由几种特定氨基酸构成的三条肽链相互缠绕形成,并经过前胶原修饰(可理解为去掉两端未缠绕部分)形成两端整齐结构的原胶原。
原胶原形成示意图
但原胶原形成完成,就可组装聚合成更大的分子结构 —— 胶原纤维 —— 在形成最终的胶原蛋白。
所以,胶原蛋白实际就是多个原胶原组装聚合形成的纤维状具有结构特性的蛋白质!
从这一句话,就可以理解胶原蛋白与原胶原的关系了!
④ 蛋白质的物理;化学性质是什么
一、物理性质蛋白质是生物体内一种极重要的高分子有机物,占人体干重的54%。蛋白质主要由氨基酸组成,因氨基酸的组合排列不同而组成各种类型的蛋白质。人体中估计有10万种以上的蛋白质。生命是物质运动的高级形式,这种运动方式是通过蛋白质来实现的,所以蛋白质有极其重要的生物学意义。人体的生长、发育、运动、遗传、繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。生命运动需要蛋白质,也离不开蛋白质。营养学上根据食物蛋白质所含氨基酸的种类和数量将食物蛋白质分三类:1、完全蛋白质这是一类优质蛋白质。它们所含的必需氨基酸种类齐全,数量充足,彼此比例适当。这一类蛋白质不但可以维持人体健康,还可以促进生长发育。2、半完全蛋白质这类蛋白质所含氨基酸虽然种类齐全,但其中某些氨基酸的数量不能满足人体的需要。它们可以维持生命,但不能促进生长发育。3、不完全蛋白质这类蛋白质不能提供人体所需的全部必需氨基酸,单纯靠它们既不能促进生长发育,也不能维持生命。根据蛋白质分子的外形,可以将其分作3类1.球状蛋白质分子形状接近球形,水溶性较好,种类很多,可行使多种多样的生物学功能。2.纤维状蛋白质分子外形呈棒状或纤维状,大多数不溶于水,是生物体重要的结构成分,或对生物体起保护作用。3.膜蛋白质一般折叠成近球形,插入生物膜,也有一些通过非共价键或共价键结合在生物膜的表面。生物膜的多数功能是通过膜蛋白实现的。 二、化学性质 ①具有两性蛋白质是由α-氨基酸通过肽键构成的高分子化合物,在蛋白质分子中存在着氨基和羧基,因此跟氨基酸相似,蛋白质也是两性物质。②可发生水解反应蛋白质在酸、碱或酶的作用下发生水解反应,经过多肽,最后得到多种α-氨基酸。蛋白质水解时,应找准结构中键的“断裂点”,水解时肽键部分或全部断裂。③溶水具有胶体的性质有些蛋白质能够溶解在水里(例如鸡蛋白能溶解在水里)形成溶液。蛋白质的分子直径达到了胶体微粒的大小(10-9~10-7m)时,所以蛋白质具有胶体的性质。④蛋白质沉淀原因:加入高浓度的中性盐、加入有机溶剂、加入重金属、加入生物碱或酸类、热变性少量的盐(如硫酸铵、硫酸钠等)能促进蛋白质的溶解。如果向蛋白质水溶液中加入浓的无机盐溶液,可使蛋白质的溶解度降低,而从溶液中析出,这种作用叫做盐析.这样盐析出的蛋白质仍旧可以溶解在水中,而不影响原来蛋白质的性质,因此盐析是个可逆过程.利用这个性质,采用分段盐析方法可以分离提纯蛋白质.⑤蛋白质的变性在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作作用下,蛋白质会发生性质上的改变而凝结起来.这种凝结是不可逆的,不能再使它们恢复成原来的蛋白质.蛋白质的这种变化叫做变性.蛋白质变性后,就失去了原有的可溶性,也就失去了它们生理上的作用.因此蛋白质的变性凝固是个不可逆过程.造成蛋白质变性的原因物理因素包括:加热、加压、搅拌、振荡、紫外线照射、X射线、超声波等:化学因素包括:强酸、强碱、重金属盐、三氯乙酸、乙醇、丙酮等。⑥颜色反应蛋白质可以跟许多试剂发生颜色反应.例如在鸡蛋白溶液中滴入浓硝酸,则鸡蛋白溶液呈黄色.这是由于蛋白质(含苯环结构)与浓硝酸发生了颜色反应的缘故.还可以用双缩脲试剂对其进行检验,该试剂遇蛋白质变紫⑦蛋白质在灼烧分解时,可以产生一种烧焦羽毛的特殊气味.利用这一性质可以鉴别蛋白质.三、作用蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中,起着十分重要的作用。生物的结构和性状都与蛋白质有关。蛋白质还参与基因表达的调节,以及细胞中氧化还原、电子传递、神经传递乃至学习和记忆等多种生命活动过程。在细胞和生物体内各种生物化学反应中起催化作用的酶主要也是蛋白质。许多重要的激素,如胰岛素和胸腺激素等也都是蛋白质。此外,多种蛋白质,如植物种子(豆、花生、小麦等)中的蛋白质和动物蛋白、奶酪等都是供生物营养生长之用的蛋白质。有些蛋白质如蛇毒、蜂毒等是动物攻防的武器。蛋白质占人体的20 %,占身体比例最大的。胆汁,尿液除外,都是蛋白质合成的。只有蛋白质充足,才能代谢正常。就像盖房子,构建身体的原材料最主要的是蛋白质。1.蛋白质是构建新组织的基础材料,是酶,激素合成的原料,;维持钾钠平衡;消除水肿。2.是合成抗体的成分:白细胞,T淋巴细胞,干扰素等,提高免疫力。3.提供一部分能量。4.调低血压,缓冲贫血,是红细胞的载体。5.形成人体的胶原蛋白。眼球玻璃体,视紫质都有胶原蛋白。6.调解酸碱度。经常吃肉的人呈酸性体质。会出现头沉---供血不足,吃充足的蛋白质,不让糖分降低。7.大脑细胞分裂的动力源是蛋白质;脑脊液是蛋白质合成的;记忆力下降8.性功能障碍9.肝脏:造血功能;合成激素,酶;解毒。缺乏蛋白质,肝细胞不健康。有一副好肝脏,人健康就有保障。10.心脏---泵器官。缺乏蛋白质会出现手脚冰凉;缺氧;心肌缺氧造成心力衰竭----死亡。11.脾胃:每天都要消化食物,消化酶是蛋白质合成的。缺乏会造成胃动力不够,消化不良,打嗝。胃溃疡,胃炎;胃酸过多,刺激溃疡面你会感觉到疼,蛋白质唯一具有修复再造细胞的功能。消化壁上有韧带,缺乏蛋白质会松弛,内脏下垂,子宫下垂脏器移位。12.四肢:人老先老腿,缺乏蛋白质肌肉萎缩;骨头的韧性减低,易骨折13.抗体会减少,易感冒,发烧。⑤ 胶原蛋白分子量的大小有标准数据吗在多少之间谢谢
有标准数据。
相对分子质量从约2kD至300kD不等。
胶原的相对分子质量大,电泳图有3条泳带,在100kD附近出现的2条泳带分别是胶原分子的α1链和α2链,在200 kD附近出现的1条泳带是胶原分子的β链。
即胶原的每条多肽链相对分子质量可达100kD,1个胶原分子相对分子质量为300kD。多肽分子量的测定方法常用SDS-PAGE,凝胶色谱法以及质谱法。有人采用凝胶过滤色谱法测定脱铬革屑中胶原水解产物分子量分布在16.1KD左右。
(5)胶原分子的等电点是多少扩展阅读:
1、胶原蛋白是生物高分子,动物结缔组织中的主要成分,也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白,占蛋白质总量的25%~30%,某些生物体甚至高达80%以上。
2、畜禽源动物组织是人们获取天然胶原蛋白及其胶原肽的主要途径,但由于相关畜类疾病和某些宗教信仰限制了人们对陆生哺乳动物胶原蛋白及其制品的使用,现今正在逐步转向海洋生物中开发。
3、由于氨基酸组成和交联度等方面的差异,使得水产动物尤其是其加工废弃物—皮、骨、鳞中所含有的丰富的胶原蛋白具有很多牲畜胶原蛋白所没有的优点,另外来源于海洋动物的胶原蛋白在一些方面明显优于陆生动物的胶原蛋白,比如具有低抗原性、低过敏性等特性。因此水产胶原蛋白可能逐步替代陆生动物胶原蛋白。
⑥ 胶原蛋白的提取分离
由于胶原是细胞外间质成分,在体内以不溶性大分子结构存在,并与蛋白多糖、糖蛋白等结合在一起,因此胶原的制备包括材料的选择、预处理、酸碱酶盐水法提取、不同类型胶原的分离和纯化。 除胶原蛋白外,动物骨中还含有油脂、多种矿物质和其他杂质,因此在被用于提取胶原蛋白之前必须进行预处理。先剔除动物骨上残留的肉质和肌腱等杂物,粉碎后用正丁醇或正己烷萃取出骨油。最后除去骨中无机物以提高胶原蛋白的得率。除去骨中的矿物质可用稀酸或EDTA溶液。有人用原料用5倍质量的1.0moL/LHCL脱钙处理2d,用正乙烷脱脂后再用胃蛋白酶酶解,在加酶量150U/g,pH值1.7,37℃条件下处理120min,然后在固液比1∶6的情况下抽提5h,在此条件下,提取率可达18%;还有人用EDTA溶液(pH7.4)浸泡骨料5d,可有效脱去骨料中的羟基磷灰石。
胶原蛋白的提取一般有三种方法:一是高压辅助的物理方法;二是用溶剂预处理结合低温或热水抽提的化学方法,根据溶剂的不同,可分为热水浸提法、酸法、碱法、盐法;三是用酶的生物化学法。一般来说,高压辅助和热水抽提针对明胶的提取,而低温抽提和酶法针对胶原的提取,但其基本原理都是根据胶原蛋白的特性改变蛋白质所在的外界环境,把胶原蛋白从其他蛋白质中分离出来。
在实际提取过程中,不同提取方法之间往往相互结合,可以得到较好的提取效果。采用超高压处理系统对原料给予高压处理一段时间,使其组织结构和胶原蛋白的三股螺旋结构发生松弛、变性,便于分离提取。 酸法提取是利用一定浓度的酸溶液在一定的条件下提取胶原蛋白,主要采用低离子浓度酸性条件破坏分子间盐键和希夫碱,而引起纤维膨胀、溶解,采用酸法提取的胶原蛋白通常成为酸溶性胶原蛋白。酸溶解法可将没有交联的胶原分子溶解出来,也可溶解含有醛胺类交联键的胶原纤维,然后释放到溶剂中。酸法是提取胶原蛋白比较常用和有效的方法,用低温酸法提取的胶原最大程度的保持了其三螺旋结构,适用于医用生物材料及原料的制备。通常的做法是将适当浓度的酸液按一定料液比加入到经过预处理的骨粉中,于0~25℃搅拌提取一定时间。在采用酸法进行胶原蛋白的提取时,注意提取温度不宜过高,以免胶原蛋白的生物活性发生破坏。取样经前处理后,匀浆在低温下用酸浸提,离心即可得酸溶性胶原蛋白(acid-soluble collagen,ASC)。作为溶剂使用的酸,主要有盐酸、磷酸、甲酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸等,但大多数研究集中于乙酸抽提,像Maria Sadowska等用0.5mol/L柠檬酸在室温下提取骨胶原蛋白,其提取率略低于乙酸提取。柠檬酸因不产生颜色和异味得以广泛使用于食品工业的胶原蛋白的提取。
酸法处理时,反应强烈,水解彻底,多生成氨基酸混合物,而且使用酸提取时,根据酸浓度、水解温度、水解时间等条件的不同,可以得到分子量不均的胶原水解物。但是在即使中等浓度酸彻底水解过程中色氨酸也会全部被破坏,丝氨酸和酪氨酸也会部分被破坏,且设备腐蚀严重。因此,酸法溶出生物医用胶原要准确控制酸度、温度、时间等影响因素。由于各种不足,酸法很少单独使用,一般和酶法配合。比如以猪皮为原料,在柠檬酸(pH8.6)和胃蛋白酶协同下提取胶原蛋白。在处理后的猪皮中加0.05moL/L含有胃蛋白酶的柠檬酸溶液(pH2.5-3)处理一段时间,然后再用NaCL盐析,最后提取率为12.35%,提取物保持了完整三股螺旋结构的I型胶原蛋白。还有人以雏鸡胸软骨为原材料,在0.5moL/L醋酸条件下经胃蛋白酶多次消化,在4℃,20000r条件下离心20min,最后应用DEAE-Sephadex A-50进行离子交换层析,之后透析,再用NaCL盐析,最后得到纯化的胶原蛋白Ⅱ型。 碱法提取即利用一定浓度的碱在一定的外界条件下提取胶原蛋白,碱处理法中常用的处理剂为石灰、氢氧化钠、碳酸钠等,用氢氧化钠浸提时效果较好。一般的是把样品匀浆后,用碱溶液多次溶胀后,再离心提取。但由于易引起蛋白质变性,如胶原肽键水解,含羟基、疏基的氨基酸全部被破坏;所得产物等电点pH值较低,天冬酞胺和谷氨酞胺分别转变为天冬氨酸和谷氨酸,得到的水解产物分子量较在酸性溶液中比低等问题,若比较严重的话,还会产生 D、L-型氨基酸消旋混合物,若D型氨基酸含量高过L 型氨基酸,则会抑制L-型氨基酸的吸收,有些D型氨基酸有毒,甚至有致癌、致畸和致突变的作用。而且碱法提取的含量较低,用氢氧化钠从鱿鱼皮中提取碱溶性胶原蛋白,其得率只有3%(以湿基计)。所以,若想提取结构完整、使用安全的胶原蛋白,很少采用此方法。有关单独采用碱法提取胶原蛋白的报道不多,一般是碱法提取和酸法提法结合使用。比如在4℃条件下,鱼骨用0.1moL/L的NaOH浸泡6h,再用2.5%NaCl浸泡6h去除杂蛋白,用10%的异丙醇溶液去除脂肪,0.1moL/L的柠檬酸浸泡3d,最后得到无色无味的胶原蛋白,提取率为11.87%。
注意,无论酸法或碱法,均可有效地提取胶原蛋白,有人分别采用醋酸- 盐酸的混合酸液(pH3.0)和NaOH溶液(pH12.0)提取骨胶原蛋白,提取率基本相当。但是,这两种方法提取胶原蛋白不仅容易影响胶原蛋白的生物活性,而且提取后产生的酸性或碱性废液必须进行适当处理,以避免对环境造成污染。 酶法提取是指可溶性胶原和酸溶性胶原被提取后,需用一些蛋白酶,如胶原酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等水解,得到不同的酶促溶性胶原蛋白。所使用的蛋白酶主要分3种:动物蛋白酶(如胰蛋白酶,胃蛋白酶),植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶,菠萝蛋白酶),微生物蛋白酶(如碱性蛋白酶,中性蛋白酶)。在对酶法水解胶原蛋白的研究中,以碱性蛋白酶应用最多。
将胶原进行限制性降解,即将末端肽切割下来,由于胶原肽链间的共价键都是通过分子末端肽里的赖氨酸或羟赖氨酸的相互作用形成的,末端肽被切下后,含三螺旋结构的主体部分可溶于稀有机酸而被提取出来。用酶处理,可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽,提高胶原蛋白的产率;而且还不会破坏胶原蛋白的三股螺旋结构,保持其特性。影响酶提取的因素有很多,如酶浓度、酶与底物的比例、酶解时间、酶解温度、pH值以及料液比等。在实际操作中,大多数采用酶复合法提取胶原蛋白,较多的是使用胃蛋白酶提取,有机酸多为乙酸。
酶解胶原蛋白的工艺主要分为单酶水解法和多酶水解法。多酶水解法又分为混合酶水解法(比如牛胰蛋白酶,链霉菌蛋白酶,芽孢杆菌蛋白酶混合)和分步酶水解法,酶法提取皮胶原具体实验工艺及条件的选取通常应考虑要开发的产品对分子量的要求,要得到分子量较小的胶原多肽一般采用多酶水解法。影响酶解效果的因素主要有:酶的种类、加酶量、酶解温度、酶解时间、pH值及料水比。采用酶法提取骨料中的胶原蛋白,既能有效缩短提取时间,又能获得具有良好生物活性的胶原蛋白,而且对环境的污染也较小。胶原蛋白不易被普通蛋白酶水解,但能被动物胶原酶断裂,断裂的碎片自动变性后可被普通蛋白酶水解。胃蛋白酶水解胶原蛋白的适宜条件为pH 1.65~1.70、温度37℃。
有人以猪骨为原料,用蛋白酶的酶解反应代替传统制胶工艺,对骨胶原的酶解反应与酶法制胶工艺进行了试验研究。结果表明:以胃蛋白酶对骨胶原的提取率最高(46.14%),其次是胰蛋白酶(43.42%),接下来是中性蛋白酶(30.14%),最后是碱性蛋白酶(21.15%)。并且通过单因素和正交试验对胃蛋白酶酶解反应中各主要影响因素进行了优化。试验结果表明,胃蛋白酶提取的最优条件是,胃蛋白酶的浓度是1%,在pH2.0的条件下酶解48h,然后在浓度为10%(w/v)的NaCL溶液中盐析24h,最后骨胶原的回收率为64.77%,骨胶原的提取率为49.75%。还有人用胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白,分别在水解0、2、6、10、14、18、22、26h时对四种不同胃蛋白酶用量(分别为1%、2%、2.5%、3%)的试样取样检测,采用一阶HILL方程模拟胃蛋白酶提取猪皮胶原蛋白的进程以及胃蛋白酶水解速率的衰减过程,最后得出2%的胃蛋白酶用量和6-7h的水解时间提取率最大。还有人用以新鲜猪皮为原料,在50-52℃的条件下用胰酶进行水解,在酶用量为 5000:1~10000:1,pH值为9,反应2-3h,原料:水为1:2的条件下酶解。结果表明:总蛋白质的提取率≥80%。
采用酶法提取胶原蛋白时,必须严格控制提取条件。首先,酶作用时间必须适当。如果时间过短,胶原蛋白就不能充分释放到提取液中,影响提取率;如果酶作用时间过长,胶原蛋白会水解过度,产生过多的苦味小分子低聚肽,不仅会增加分离纯化的难度,也会影响胶原蛋白的功能特性和生物活性。其次,酶解温度要适宜。温度过低,酶的作用效果不明显;温度过高会引起酶的失活和胶原蛋白的变性。据报道,当介质pH略低于中性时,胶原蛋白的变性温度为40~41℃,当介质pH为酸性时,胶原蛋白的变性温度为38~39℃,而且鱼皮胶原蛋白的变性温度要比猪皮胶原蛋白的变性温度低7~12℃。所以,如果要使提取的胶原蛋白具有良好的生物活性,在提取过程中应使提取温度低于变性温度。第三,需选用适当的酶。一般从陆生哺乳动物组织中提取胶原蛋白时,采用胃蛋白酶在其最适作用温度下进行提取是合理的,但对于鱼类等水生动物,由于其胶原蛋白的变性温度比陆生哺乳动物低,因此许多蛋白酶便不适用,如果在这些酶的最适作用温度下提取可能会破坏胶原蛋白的某些功能特性和生物活性。采用酶法提取胶原蛋白及其多肽的研究主要是从动物皮及其加工副产物中,应用酶法从动物骨中提取胶原蛋白及其多肽报道较少。 指使胶原分子内部和分子间通过共价健结合提高胶原纤维的张力和稳定性的方法。该法又分为物理方法、化学方法和低温等离子体法,生物学方法;其中物理方法、化学方法是最常用的交联改性方法,生物学方法改性胶原蛋白主要在研究有关动物老化的生命现象中涉及,在研制胶原基生物医学材料中少见报道。
物理方法
通过物理手段对胶原蛋白改性有紫外线照射、重度脱水、λ射线照射和热交联等方法。胶原溶液如被紫外线等照射,将在分子间产生交联,粘度增加,生成凝胶。常用的紫外线交联胶原膜的方法是将胶原膜放在铝箔上,距离254 nm紫外灯20 cm高度,照射1~5 h。对紫外线照射的胶原膜进行力学性能和胶原酶试验表明:交联胶原膜的萎缩温度Ts和抗胶原酶解的能力均显着高于未交联胶原膜。
重度脱水也是胶原蛋白物理改性中常使用的方法,该法是通过脱水导致胶原分子间交联,从而增加变性温度,改善胶原的性能。改性后胶原膜生物相容性提高,降低了水溶性,影响了膜与成骨细胞的生物相容性。物理方法改性原蛋白的优点是可避免外源性有毒化学物质进入胶原内,缺点是胶原膜交联度低,且难以获得均匀一致的交联。
化学方法
化学方法比物理方法改性交联度高,且能获得均匀一致的交联,对调节、控制胶原的各性质均有效。已广泛应用于各种化学试剂交联胶原,以提高其交联度、力学性能及生物相容性。化学改性法具体又可分为使用化学试剂交联、侧链的修饰、生理活性物的固定化三种方法。
化学试剂交联法中常用的化学交联剂有戊二醛、己异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基磷等,其中戊二醛是应用最广泛的试剂,大量实验证明:戊二醛能提供有效交联,但有细胞毒性,且其用量难以控制。另外,随着交联度的增加,吸水能力和膨胀度却会降低。酰基叠氮化物、聚环氧化物或京尼平交联等,不会引入明显的毒性,且可获得理想的交联效果。所见报道中,多使用单一交联剂对胶原蛋白交联改性,但也有使用混合交联剂的,如为了解决人工心脏瓣膜晚期钙化问题,筛选出环氧丙烷化学改性戊二醛处理生物瓣的方法,可明显减低瓣膜组织胶原蛋白末端游离羧基含量。动物实验表明,经改性后的瓣膜组织能保持较好的组织稳定性和机械抗张强度、免疫原性测试为阴性,符合临床应用。
侧链修饰就是对胶原分子侧链的氨基和羧基进行化学修饰,改善电荷分布,使胶原获得新的特性,例如将胶原氨基丁二酰化,可变成负电荷丰富的胶原。与未修饰胶原蛋白相比血小板粘附能,血纤维蛋白形成能都弱,有抗栓性;然而如将胶原羧基甲基化获得的正电荷丰富的胶原,生理条件下血小板粘附能、活化能都高。与交联改性相比,在生物材料领域,利用侧链修饰对胶原改性所做的工作还较少。
化学方法虽然可获得均匀一致的交联,但存在着引入外源有毒试剂,残留试剂难清除等缺点。一些报道表明,低温等离子体技术改性胶原或胶原复合膜可使材料表面引入不同基团,改变材料表面化学组分和结构,从而改变材料的特性,如使之更具有细胞识别位,提高表面能,改善表面极性等。 胶原单独使用,物理机械性能差(这几乎是天然材料共有的弱点),性能单一,且因有亲水性强,在体内易被胶原酶降解等不可避免的弱点限制了它的应用。但如将胶原与其它物理、化学性质不同的合成或天然高分子共混,组成一种多相固体材料,在性能上胶原与其它高分子互相补充,胶原基“复合材料”的概念由此产生。
已见报道的与胶原共混的合成高分子有不可生物降解的聚甲基烯酸酯及丁烯酸酯、聚氨酯、聚酰胺和可生物降解的聚乙烯醇、聚乳酸、聚谷氨酸、聚乙醇酸等,20世纪80~90年代初最有代表性的是聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)和聚乙烯醇与胶原共混,其报道集中于复合方法、复合机理、理化及生物学性能、材料表面和整体结构、表面修饰的方法和机理以及水凝胶的溶胀扩散等,尤其是水凝胶制备、作软组织替代、药物缓释等。后来利用可生物降解的聚乳酸、聚乙醇酸、聚酸酐、聚谷氨酸、聚亚乙基四乙酸等与胶原共混改性制备可吸收外科缝线、组织工程支架材料(如组织引导再生材料)的相关研究相对增多。不过合成高分子与胶原蛋白共混复合一些问题,如尼龙等不降解高分子材料不能进行生理代谢,与胶原蛋白复合后只能用做皮肤的外层敷料不能永久代替皮肤,而聚谷氨酸等可生物降解材料,如果相对分子质量小则强度不够,相对分子质量大难溶于水,溶解时还出现降解,影响材料的机械强度。
天然高分子材料中最具代表性的是天然蛋白质和天然多糖,多糖主要有软骨素、HA(透明质酸)、壳聚糖、肝素等,多糖复合材料比较集中于可吸收性外科缝线、药物释放的载体、皮肤替代物、透析膜、止血剂、医用引导组织再生材料、骨替代材料、组织培养系统的支架。
⑦ 胶原的分子结构有何特点
..
胶原蛋白的
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target="_blank">基本单位称原胶原蛋白,它是由大约1000个
氨基酸
基构成的α―
肽链所组成,其分子量约为30万。根据α―肽链
结构
与组成的不同,可将其
分为由两种不同的α肽链,即由两条α1(I)肽链和一条α2(I)肽链所组成
的I型
胶原
和由三条相同α肽链所组成的II、III、IV型胶原。它们均具有重复
的三重序列结构(甘氨酸―X―Y)n。X和Y可为不同
氨基酸残基
的三分之
一。现已阐明:α1(I)链具有1056个氨基酸残基,其中1014个组成连续的
三重体。非
三股螺旋
区部分,称之为末端肽,所以
分子
有16个N端
残基
和26个C端肽
构成三股螺旋的伸展部分。α2(I)肽链同样具有构成三重结构的1014个氨
基酸残基。
原胶原
分子中不含
色氨酸
残基,
酪氨酸
残基也
抗原性
很弱,具有优良的
生物相容性
很少。