① 请教大鼠原代肝细胞的分离和培养的问题
我记得好像有这一方面的的论文，题目都一样的《大鼠原代肝细胞的分离与培养》是徐丽娜 鞠雷 顾宪锐 张恒 马玉忠 河北农业大学动物科技学院的
http://www.cqvip.com/qk/96216X/200712/26163977.html
你下载来看就行了（不过下载要钱）
下面我给你，我做的一个过程（仅做参考）
我做的就是大鼠原代肝细胞，养了一段时间了，下面是我的实验步骤，希望对你有所帮助。
1）3-5天乳鼠，断头处死，75%酒精浸泡3-5分钟。
2）移入超净台内，无菌取下肝脏，放入冷PBS内，撕下被膜等。
3）移入25ml烧杯内，剪成1mm3左右大小，PBS清洗至上清无色。
4）移入三角瓶内，加5倍量0.05%胰酶37度消化20分钟。
5）终止消化，静置，弃上清。加0.05%胶原酶消化20分钟。
6）100目过滤。离心，800，3分钟。
7）计数，调整浓度，接种。24小时第一次换液，以后没两天换一次液，4、5天可以铺满。
二、方法
1．传统门静脉灌流消化法（传统门脉灌流法）：参照邹氏等文献方法[3,4,5]。
2．低浓度胶原酶原位循环灌流法：
2.1取Wistar大鼠，用2%戊巴比妥钠10mg/100g体重、肝素20 u/100g体重分别腹腔注射以麻醉和抗凝。
2.2 10-15分钟后固定大鼠，75%酒精消毒，紫外灯照射15-30分钟。腹部再次75%酒精消毒后正中切开打开腹腔并更换器械。
2.3显露肝门部门静脉并游离2-3cm；显露游离肝下下腔静脉2-3cm，各置一结扎线，暂不结扎。
2.4穿刺针插入门静脉后立即结扎固定，尽快接通硅胶管并启动蠕动泵（无泵时，输液器亦可），同时剪断肝下下腔静脉远端。
2.5用D-Hanks液20-30ml/min快速灌注清除肝内血液，1分钟内即可见肝脏颜色变浅，持续灌注10分钟至肝脏呈米黄色。同时切开胸腔结扎肝上下腔静脉。
2.6插另一硅胶管入肝下下腔静脉并结扎固定，换D-Hanks液为胶原酶消化液(370C预热)循环灌注消化，灌流速度为10-20ml/min，持续时间10-20分钟至肝质变软，压之凹陷不易恢复。
2.7停止灌注，小心剪取各肝叶置入消毒平皿内，加入适量肝细胞洗涤液（4oC预冷），撕碎肝脏并祛除纤维结缔组织，制成混合肝脏细胞悬液。
2.8 100目筛网过滤入50ml离心管，500rpm离心1-2分钟。去上清，沉淀加入RPMI 1640 （4oC预冷）20-30ml洗涤3次。
2.9肝细胞沉淀加入肝细胞培养液重悬为10ml，取适量计数并用0.4%台盼蓝染色判断存活率。后即可按实验设计接种培养
我们目前正在做大鼠肝脏细胞的分离培养（原位循环灌注法），我把大体步骤和大家交流一下。
1，动物称重，戊巴比妥麻醉。
2，固定，消毒，腹部正中十字切口，或者“U”型切口进腹。
3，分离门静脉和肝下下腔静脉，分别插管，从门静脉注入肝素，使大鼠全身肝素化。
4，阻断肝上下腔静脉（位置较深，分离结扎有难度，可用哈巴狗血管夹夹住，亦可用消毒棉签压迫）
5，从门静脉内注入D-HANKS，直至肝下下腔静脉插管内流出来的液体中不含或含少量红细胞，肝脏呈米黄色。
6，此时接上自制的胶原酶循环灌注装置（循环通路：门--肝--肝下下腔--蠕动泵--门），灌注15分钟左右，到肝脏表面呈颗粒状为止。
7，取下肝脏，剪碎，去结缔组织，放入含有胶原酶的三角瓶中继续水浴消化10分钟后加入HANKS 或者1640终止消化。
8，将3角瓶带入超净台内，在超净台内完成以下步骤。
9，50目筛网，200目筛网，1640两次吹打过滤。获得细胞悬液。
10，1640洗涤离心3次，收集细胞，制成一定浓度的悬液。
11，计数，调整浓度，培养。
（大体步骤，太多细节不赘述，我们曾用此方法分离乳猪，大鼠的肝细胞，结果令人满意）
注意点：
1，腹部切口位置要合适，避免误入胸腔导致大鼠死亡。
2，插管要固定，避免滑脱。
3，阻断肝上下腔可以用小哈巴狗，但我们实际发现用下毒棉签压迫更为简单，效果也令人满意。
4，所有灌流液均要预热。
5，肝脏消化完毕后，立即拿到超净台内操作，注意无菌观念。
6，消化时间8宜过长。
7，组织块比较大，通过50目筛网有困难时，可用消毒注射器活塞轻轻挤压组织块，勿研磨！
优点：
1，消化充分，且节约胶原酶。胶原酶比较昂贵 ：）
2，在肝脏离体之前大鼠保持呼吸心跳，从而最大限度的保持了细胞的活力。
缺点：
需要一定的手术技巧，了解肝脏循环结构，且血管插管有一定难度。
② 胶原酶和胰酶在细胞原代培养中的区别
胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，作用对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。消化原代培养的上皮类细胞用此酶效果更好。
胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂.胰蛋白酶是一种胰脏制品,对蛋白质有水介作用,主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开,在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同,对细胞的消化能力也不同,胰蛋白酶对细胞的作用,取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等.
胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶,对胶原有很强的消化作用.适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织,它对细胞间质有较好的消化作用,对细胞本身影响不大,可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害.该酶分离效果好,即使有钙、镁离子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培养液配制,即操作简便又可提高细胞成活率,最终浓度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用缓和,无需机械振荡,但胶原酶价格较高,大量使用将增加实验成本.
③ 肝细胞培养
④ 鸡原代肝细胞分离时需要多少组织
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：
1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.
2消化酶的选择及使用
新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g?L1,我们使用的为0.8 g?L1.胶原酶最好现用现配.
3消化程度的把握
新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力;消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r?min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.
4接种的细胞密度
心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个;若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.
⑤ 原代肝细胞培养问题
原代肝细胞很容易贴壁生长，4小时肯定能贴壁。
“然后就有浑浊的沉淀，那个沉淀是肝细胞吧？”将此沉淀用培养液或pbs稀释，加台盘蓝染色，显微镜下观察，若为活细胞，通常就是肝细胞了，要培养好，最好有大于85%以上的活性。
原代肝细胞最好生长在鼠尾胶原上，也就是用鼠尾胶原铺板，然后再普细胞。
4小时后换液，然后每20小时左右换液，通常原代肝细胞难以增值，但是维持20天左右没问题。
⑥ Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶有什么区别
胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细 胞，用于哺乳动细胞的分离。
胶原酶Ⅱ适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织。