用胶原酶消化脾脏要多少体积

① 流式细胞术的作用原理

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点。

将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷流式细胞术酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘则备液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。

检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既做判可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。

细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动孙胡毁室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

② 脾脏肿大怎么办

病情分析:脾肿大腹部有肿块,且在左侧明显时,多提示为脾脏肿大.正常情况下脾脏在肋缘下不能 扪及.因此,不论何种体位,凡在肋缘下可扪及脾脏时,均表示为脾肿大. 引起脾脏肿大的原因,以慢性,急性反复发作的感染为多见.急性感染,可见于急 性病毒性肝炎,斑疹伤寒,败血症,亚急性细菌性心内膜炎等,此类脾脏肿大以轻 度至中度肿大为主,多数伴有压痛,感染控制后短期内一般可恢复正常.慢性感染 的疾病,包括血吸虫病,感性性心内膜炎,梅毒,结核病等,此类脾肿大可呈中度 至重度,质地坚硬,多有久居流行病区史,一般治疗后不易恢复正常,特别是反复 发作的感染,可引起脾脏的显着肿大. 意见建议:当出现脾肿大并伴有其它症状时,要仔细观察后再下结论.如伴有发热时,且热型 为长期间歇型或驰张热型,可考虑为急性血吸虫病.如果出现脾脏肿大,伴发热, 贫血和出血倾向时,多考虑急生白血病.若伴不规则的周期性发热且淋巴结和肝脏 肿大的患者,多考虑为何杰金病.脾肿大伴发黄疸,考虑是否为溶血性贫血或病毒 性肝炎.如果同时出现贫血,胸骨后压痛,皮肤粘膜有出血现象时,可能为白血病 或造血系统疾病.如脾肿大明显,多昌是慢性粒细胞性白血病的典型临床表现. 生活护理:一般说来,脾肿大的发生多提示病情变化复杂,疾病较重,所以发现脾肿大后,最 好去内科先进行常规检查和血液涂片,血清学检查,肝功能试验及其它各项化验, 检查,尽早进行诊断,尽早进行病因治疗.

③ 剪碎后的小鼠脾脏用什么处理

用胰蛋白酶处理。
取小鼠甲脾春做脏剪碎，用胰蛋白酶毁激处理使其分散成单个细胞，加入培养液扒余衡制成单细胞悬液。

④ 肿瘤细胞消化液中胶原酶、透明质酸、DNA酶配合什么比例比较好胶原酶用哪个型的谢谢您的关注和回答

不同肿瘤组织 其中各种蛋白种类、比例各不相同，则相应消化酶的种类和比例也可适当改变，若要制备肿瘤悬液，个人推荐 先查找中英文文献，参考文献中的消化方法

⑤ 脾虚易生病是什么原因哪些食物有着养护脾脏的作用

脾虚易生病是什么原因？

在腹部的右上角位置，拥有身体之中关键的一个淋巴器官脾脏。脾脏归属于身体的一个关键血库，可以存储血夜，还可以将血液运输至全部血液循哗拆春环系统之中，可以提升总体的血容量。并且脾脏还可以过滤掉血液中的一些脏东西，而且可以生产出人免疫球蛋白，拥有免疫的功能。

尤其是发生脾脏过度孱弱而造成体内湿气重太重的情况下，可以用薏米仁配搭上红小豆熬水食用，可以具有健脾胃、利湿及其放脓的功效。

四、檽米

檽米之中不仅含有很多的蛋白、维他命、木薯淀粉及其糖原化学物质，还含有非常丰富的铁、磷、钙等各种矿物质元素，拥有健脾胃养胃、补血补气滋阴养血的功效。并且檽米温性入胃经，拥有健脾养血的实际效果。假如发生脾虚现象，可以用檽米熬粥食用，拥有辅助医治脾虚的作用。

总得来说，以上4类食材适度多吃一些，可以具有养护脾脏的功效。除此之外，还可以适度地吃一些地瓜、大枣、红萝卜、平菇、莲子、红小豆、东瓜等食材，可以具有养护脾脏及其改进脾虚现象。

温馨提醒：

需要注意的是，一切食材无法代替药品。假如发生了较为突出的脾虚现象，务必在医师引导下合理服食一些药品开展医治。而且要特别注意多及时补充一些开水并提升健身运动。并留意心理状态及其作息时间层面的调节，才能有效的改进脾虚现象，做到维护保养脾脏身心健康的功效。

⑥ Collagenase D是否就是Collagenase IV

胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶的化学本质是一种蛋白质，因此，这对温度、PH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感，极易受到外界条件的影响而改变其本身的构象和性质。 胶原酶按其存在的方式不同可分为人体内源性胶原酶和药用胶原酶两种。人体内源性胶原酶是指人体内部本身所具有的胶原酶，如牙龈、触膜等上皮组织和关节滑膜、椎间盘内都不同程度的存在着这种胶原酶，它在体内胶原蛋白的分解过程中发挥着不可或缺的作用。药用胶原酶是指利用生物制药的高科技手段从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵液中提取、纯化并精制而得的白色或类白色无菌冻干粉针生物制剂。 胶原酶（collagenase）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。 胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。常用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%~0.3%。胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。 1、胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细 胞，用于哺乳动细胞的分离。 2、胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它能消化多种组织。 3、胶原酶Ⅴ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它可用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。 4、胶原酶Ⅱ适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织。 胶原酶的配置 胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌和储藏。 注意： 因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。 钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培养液配制。 胶原酶的使用 1.将漂洗、修剪干净的组织剪成1~2mm3左右小块 2.将组织块放入离心管（三角烧瓶）中加入30~50倍体积的胶原酶溶液，旋紧盖子（密封烧瓶）。 3.将烧瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱内，每隔3min振摇一次，如能放在37℃的恒温震荡水浴箱中则更好。 消化时间与组织的类别很有关系，对于某些肿瘤组织或其他较致密结缔组织，消化时间4~48h，对于容易消化的组织可以采用37℃震荡消化15~45min，也可以根据具体情况而定。如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分。上皮组织经胶原酶消化后，由于上皮细胞对此酶有耐受性，可能仍有一些细胞团未完全分散，但成团的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此，如无特殊需要可以不必再进一步处理。 4.收集消化液（有时含个别组织块及没有充分消化的组织碎屑则需用100目不锈钢网过滤），离心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者无血清培养液离心漂洗1~2次，去除上清，加培养液制成细胞悬液，接种培养瓶。

⑦ 干细胞消化传代要注意哪些问题

一、贴壁细胞的消化 :
常用的消化方法主要有酶消化法、离子螯合剂、物理法和冷冻法。其中最常用的是酶消化法。
1、 酶消化法
贴壁干细胞酶消化传代时通常采用两种方式：1）、加入胰酶等干细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；2）、加入胰酶后，镜下观察待干细胞开始脱落时，弃去胰酶，加入培养液并分瓶。但前者太麻烦，而后者有可能对干细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的干细胞先脱落。
常用的消化酶有:
1）、胰酶搏正 这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据干细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的干细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于干细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。
2）、胶原酶 这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下干细胞。这种方法作用温和，对干细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。

胰酶的质量是影响干细胞的消化的关键因素之一，如果配的比较标准，消化的时候就容易消化，反之就不易消化。还要在你看到消化过头的情况下，如果干细胞下来的比较多了，这时可以连同CMF或PBS加上营养液一起传。营养液中有血清，胰酶遇到血清就会自动终止消化，但这样操作对干细胞是有一定的影响的。
对于容易消袭亩化的干细胞，加入PBS缓冲液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将干细胞消化单细胞。

在此介绍一种简单省事并且效果好、不损失干细胞的方法：倒掉旧培养液，加入少量胰酶冲洗一下，倒掉，再加入0.125-0.25%胰酶约6-10滴或1ml（25ml bottle）消化，再加入适量新培养基中和并分瓶。

这里，胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对干细胞的活性损伤较大，并有部分干细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则干细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤干细胞活性。 影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的拍银森温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 。
2、离子螯合剂
离子螯合剂：不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测干细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。
1）、EDTA 用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显着影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度，它不能被中和。因此，消化下来的干细胞要洗一遍。
2）、商品化的无酶消化液 有些消化酶液对干细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。

对于较难消化的干细胞，可以用2%利多卡因消化5-8分钟，然后再弃去，加培养基吹打。或者是弃去培养液后，用0.04%的EDTA冲洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室温孵育5min，弃去大部分EDTA，加入与剩余EDTA等量的胰酶（预热）总体积1/10v。消化到有干细胞脱落。但大量使用EDTA对干细胞有损伤作用。也可以先用PBS把干细胞洗两遍，使瓶内没有血清了，减少对胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在少量干细胞消化下来时，拿着瓶口，运用手腕的力量轻轻震荡瓶内液体，这样干细胞很快就下来了，还不需要吹打，分散也均匀。
3、物理法：直接吹打或用细胞刮子将干细胞刮下来。
4、冷冻法：
此方法仅能用于细胞传代时无法使组织上的细胞脱落下来的情况。本方法的原理是因干细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。优点是：对干细胞损伤小，不需要中止或洗干细胞，方便，不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的干细胞。不足是干细胞常成小片脱落。此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。具体过程是：1）、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5ml/孔)，2）、再加0.5ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落，3）、轻轻吹打，细胞即完全脱落，4）、按一定比例传代。
消化时间和干细胞类型、消化液的消化能力、干细胞的密度等多种因素有关。干细胞消化过程要注意消化时间。一般养一种新的干细胞要摸索一下消化时间，掌握干细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强，配好后可分装成小管，一次用完，其余冻在－20℃，以保持酶活力。消化液只需铺满瓶底即可，可放入培养箱中，因外在37℃时酶的活力高于常温，有利于缩短消化时间。还有一种方法，就是将胰酶铺满瓶底后，轻摇培养瓶，使胰酶与干细胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待干细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可。细胞生长到覆盖70～80％瓶底时消化较好，若干细胞密度过大则消化后干细胞易成团。

消化时间不应超过5分钟，否则对干细胞损害很大。消化液覆盖干细胞，成一薄膜，然后反复倾斜，使消化液冲刷干细胞，当干细胞收缩，部分干细胞脱落时，可用完全培养基马上中和，同时吹打壁上干细胞。
在消化过程中经常出现细胞铺不开的问题，原因有二：一是消化时离心管中的细胞没有吹打开，解决方法是离心后的细胞加3ml左右的培养基，用吸管轻轻吹打，吹打开后，再加培养基，这样细胞不会成团，培养基太多，细胞不容易吹打开。二是接种时，培养瓶中先加培养基，再接种细胞，接种后轻轻晃动摇匀。先加细胞后加培养基或不晃动摇匀，其结果就是细胞铺不开。

二、 贴壁干细胞的传代扩增
贴壁干细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对干细胞进行传代扩增。
对于贴壁不太紧的细胞，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的干细胞如CHO，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为：
• 将长成致密单层干细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去；
• 加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润；
• 一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化；
• 视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。

传代细胞培养注意事项：
1.严格的无菌操作 .
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养干细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
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⑧ 胶原酶和胰酶在细胞原代培养中的区别

胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，作用对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。消化原代培养的上皮类细胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂.胰蛋白酶是一种胰脏制品,对蛋白质有水介作用,主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开,在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同,对细胞的消化能力也不同,胰蛋白酶对细胞的作用,取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等.

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶,对胶原有很强的消化作用.适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织,它对细胞间质有较好的消化作用,对细胞本身影响不大,可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害.该酶分离效果好,即使有钙、镁离子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培养液配制,即操作简便又可提高细胞成活率,最终浓度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用缓和,无需机械振荡,但胶原酶价格较高,大量使用将增加实验成本.

⑨ 胶原酶消化用什么浓度edta终止

胶原酶消化用血清或者含血清的培养基终止。胶原酶一般浓度在百分之0.2左右，使用它来消化细胞滑差时，注意它能显着影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶，而且不能被终和。终止是用血清蛋白，血颂明清含有野让告非特异性胰蛋白酶抑制剂。保存于负20度。

⑩ 什么是胶原酶消化法

就是用胶原酶处理消化组织达到分离细胞的目的，所用胶原酶有不同类型：
1、胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，用于哺乳动细胞的分离。
2、胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它能消化多种组织。
3、胶原酶Ⅴ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它可用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。
4、胶原酶Ⅱ适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织