胶原酶没过滤怎么办

⑴ 请教大鼠原代肝细胞的分离和培养的问题

我记得好像有这一方面的的论文，题目都一样的《大鼠原代肝细胞的分离与培养》是徐丽娜 鞠雷 顾宪锐 张恒 马玉忠 河北农业大学动物科技学院的
http://www.cqvip.com/qk/96216X/200712/26163977.html
你下载来看就行了（不过下载要钱）

下面我给你，我做的一个过程（仅做参考）
我做的就是大鼠原代肝细胞，养了一段时间了，下面是我的实验步骤，希望对你有所帮助。
1）3-5天乳鼠，断头处死，75%酒精浸泡3-5分钟。
2）移入超净台内，无菌取下肝脏，放入冷PBS内，撕下被膜等。
3）移入25ml烧杯内，剪成1mm3左右大小，PBS清洗至上清无色。
4）移入三角瓶内，加5倍量0.05%胰酶37度消化20分钟。
5）终止消化，静置，弃上清。加0.05%胶原酶消化20分钟。
6）100目过滤。离心，800，3分钟。
7）计数，调整浓度，接种。24小时第一次换液，以后没两天换一次液，4、5天可以铺满。

二、方法

1．传统门静脉灌流消化法（传统门脉灌流法）：参照邹氏等文献方法[3,4,5]。

2．低浓度胶原酶原位循环灌流法：

2.1取Wistar大鼠，用2%戊巴比妥钠10mg/100g体重、肝素20 u/100g体重分别腹腔注射以麻醉和抗凝。

2.2 10-15分钟后固定大鼠，75%酒精消毒，紫外灯照射15-30分钟。腹部再次75%酒精消毒后正中切开打开腹腔并更换器械。

2.3显露肝门部门静脉并游离2-3cm；显露游离肝下下腔静脉2-3cm，各置一结扎线，暂不结扎。

2.4穿刺针插入门静脉后立即结扎固定，尽快接通硅胶管并启动蠕动泵（无泵时，输液器亦可），同时剪断肝下下腔静脉远端。

2.5用D-Hanks液20-30ml/min快速灌注清除肝内血液，1分钟内即可见肝脏颜色变浅，持续灌注10分钟至肝脏呈米黄色。同时切开胸腔结扎肝上下腔静脉。

2.6插另一硅胶管入肝下下腔静脉并结扎固定，换D-Hanks液为胶原酶消化液(370C预热)循环灌注消化，灌流速度为10-20ml/min，持续时间10-20分钟至肝质变软，压之凹陷不易恢复。

2.7停止灌注，小心剪取各肝叶置入消毒平皿内，加入适量肝细胞洗涤液（4oC预冷），撕碎肝脏并祛除纤维结缔组织，制成混合肝脏细胞悬液。

2.8 100目筛网过滤入50ml离心管，500rpm离心1-2分钟。去上清，沉淀加入RPMI 1640 （4oC预冷）20-30ml洗涤3次。

2.9肝细胞沉淀加入肝细胞培养液重悬为10ml，取适量计数并用0.4%台盼蓝染色判断存活率。后即可按实验设计接种培养

我们目前正在做大鼠肝脏细胞的分离培养（原位循环灌注法），我把大体步骤和大家交流一下。
1，动物称重，戊巴比妥麻醉。
2，固定，消毒，腹部正中十字切口，或者“U”型切口进腹。
3，分离门静脉和肝下下腔静脉，分别插管，从门静脉注入肝素，使大鼠全身肝素化。
4，阻断肝上下腔静脉（位置较深，分离结扎有难度，可用哈巴狗血管夹夹住，亦可用消毒棉签压迫）
5，从门静脉内注入D-HANKS，直至肝下下腔静脉插管内流出来的液体中不含或含少量红细胞，肝脏呈米黄色。
6，此时接上自制的胶原酶循环灌注装置（循环通路：门--肝--肝下下腔--蠕动泵--门），灌注15分钟左右，到肝脏表面呈颗粒状为止。
7，取下肝脏，剪碎，去结缔组织，放入含有胶原酶的三角瓶中继续水浴消化10分钟后加入HANKS 或者1640终止消化。
8，将3角瓶带入超净台内，在超净台内完成以下步骤。
9，50目筛网，200目筛网，1640两次吹打过滤。获得细胞悬液。
10，1640洗涤离心3次，收集细胞，制成一定浓度的悬液。
11，计数，调整浓度，培养。

（大体步骤，太多细节不赘述，我们曾用此方法分离乳猪，大鼠的肝细胞，结果令人满意）

注意点：
1，腹部切口位置要合适，避免误入胸腔导致大鼠死亡。
2，插管要固定，避免滑脱。
3，阻断肝上下腔可以用小哈巴狗，但我们实际发现用下毒棉签压迫更为简单，效果也令人满意。
4，所有灌流液均要预热。
5，肝脏消化完毕后，立即拿到超净台内操作，注意无菌观念。
6，消化时间8宜过长。
7，组织块比较大，通过50目筛网有困难时，可用消毒注射器活塞轻轻挤压组织块，勿研磨！

优点：
1，消化充分，且节约胶原酶。胶原酶比较昂贵 ：）
2，在肝脏离体之前大鼠保持呼吸心跳，从而最大限度的保持了细胞的活力。
缺点：
需要一定的手术技巧，了解肝脏循环结构，且血管插管有一定难度。

⑵ 谁知道0.2%Ⅱ型胶原酶和10%胎牛血清的怎么配制

每 100mg 胶原酶加入 50ml 培养液中 搅拌
均匀 用 0.2 微米 微孔滤膜过滤分装 -20 低温冰箱保存

450mlDMEM+50mlFBS

⑶ 我颈椎盘突出,胶原酶打了已有三个月了怎么还没好

目前,治疗此类病的方法很多,主要分三大类:一是物理疗法,如传统的牵引、推拿、按摩、火罐、针灸以及通过红外线、微波等热、光、电、声的物理方法治疗。二是微创疗法,如用激光和胶原酶进行治疗。即用激光汽化椎间盘,胶原酶软化椎间盘,再用椎间盘内窥镜,取掉压迫神经的髓核,来根治此病。三是通过手术方法治疗,即切除压迫神经根的髓核。患者宜采取哪种方法治疗,需根据病情,对症治疗。

⑷ 鼠尾胶原蛋白I型，用那一种胶原酶可以溶解

醋酸就可以.

1．将胶原加入到0.1M 的醋酸中，制备成浓度为0.1%的溶液。在室温中搅拌1-3小时直到完全溶解。

2．建议将溶液转移到拧口的玻璃瓶中，并小心的在瓶底铺上一层氯仿。氯仿的量约为胶原溶液的10%。不要晃动或搅拌。在2-8度中放置过夜。在无菌条件下转移上层的胶原溶液。我们不建议用过滤的方法无菌化。已经发现该方法会导致丢失蛋白。

3．稀释一定数量的胶原溶液。

4．按照6-10ug/cm2的浓度包被培养瓶。在室温或37度结合数小时或者2-8度过夜。

5．从包被表面除去多余的液体。过夜干燥。如果胶原溶液不是无菌的，这时候可以在无菌细胞操作室中暴光在紫外线下过夜消毒。 在接种细胞前用无菌的水漂洗。

⑸ 腰突注射胶原酶后坐骨神经痛有所缓解，但没彻底好，怎么办

建议采用中医外敷的方法治疗，因为完全无副作用，缓解或康复后也不易复发。避免了口服药引起的胃肠不适，以及打针（封闭）对肝肾的损害。止疼类药物（口服、针剂）副作用大，可引起骨质疏松症。 给您介绍一个疗效显着、见效迅速的外敷喷剂，用起来非常方便。治疗腰椎病、腰椎间盘突出、坐骨神经痛等引发的各种症状的效果非常好。尤其是止疼痛、祛寒除湿、温经通络的效果非常棒！！！建议您试试，初次使用疼痛就会得到非常明显的缓解，只要在用上几次（病情严重可适当增加用药次数），病痛就可以消除了。需要说明，我可不是别人雇我当托卖假药坑人做缺德事。只因为治疗效果这么好的药实在是难得也绝对值得一试，我患有腰椎间盘突出，而我的腰椎疼痛和大腿的酸胀麻木也是实实在在用这个药治好的，用了大概三四次症状就全没有了。您考虑一下，对照自己的病症。要是觉得对病情恢复有帮助，您就可以试试。相信用后您的症状一定也会大大缓解，并能尽早康复！用谷歌搜‘力肤叶' 就能找到。

⑹ Collagenase D是否就是Collagenase IV

胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶的化学本质是一种蛋白质，因此，这对温度、PH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感，极易受到外界条件的影响而改变其本身的构象和性质。 胶原酶按其存在的方式不同可分为人体内源性胶原酶和药用胶原酶两种。人体内源性胶原酶是指人体内部本身所具有的胶原酶，如牙龈、触膜等上皮组织和关节滑膜、椎间盘内都不同程度的存在着这种胶原酶，它在体内胶原蛋白的分解过程中发挥着不可或缺的作用。药用胶原酶是指利用生物制药的高科技手段从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵液中提取、纯化并精制而得的白色或类白色无菌冻干粉针生物制剂。 胶原酶（collagenase）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。 胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。常用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%~0.3%。胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。 1、胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细 胞，用于哺乳动细胞的分离。 2、胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它能消化多种组织。 3、胶原酶Ⅴ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它可用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。 4、胶原酶Ⅱ适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织。 胶原酶的配置 胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌和储藏。 注意： 因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。 钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培养液配制。 胶原酶的使用 1.将漂洗、修剪干净的组织剪成1~2mm3左右小块 2.将组织块放入离心管（三角烧瓶）中加入30~50倍体积的胶原酶溶液，旋紧盖子（密封烧瓶）。 3.将烧瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱内，每隔3min振摇一次，如能放在37℃的恒温震荡水浴箱中则更好。 消化时间与组织的类别很有关系，对于某些肿瘤组织或其他较致密结缔组织，消化时间4~48h，对于容易消化的组织可以采用37℃震荡消化15~45min，也可以根据具体情况而定。如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分。上皮组织经胶原酶消化后，由于上皮细胞对此酶有耐受性，可能仍有一些细胞团未完全分散，但成团的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此，如无特殊需要可以不必再进一步处理。 4.收集消化液（有时含个别组织块及没有充分消化的组织碎屑则需用100目不锈钢网过滤），离心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者无血清培养液离心漂洗1~2次，去除上清，加培养液制成细胞悬液，接种培养瓶。

⑺ 胶原酶和胰酶在细胞原代培养中的区别

胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，作用对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。消化原代培养的上皮类细胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂.胰蛋白酶是一种胰脏制品,对蛋白质有水介作用,主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开,在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同,对细胞的消化能力也不同,胰蛋白酶对细胞的作用,取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等.

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶,对胶原有很强的消化作用.适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织,它对细胞间质有较好的消化作用,对细胞本身影响不大,可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害.该酶分离效果好,即使有钙、镁离子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培养液配制,即操作简便又可提高细胞成活率,最终浓度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用缓和,无需机械振荡,但胶原酶价格较高,大量使用将增加实验成本.

⑻ 腰间盘突出打了胶原酶三个多月了，没啥效果

如果一点效果都没有可以换其他方法来治疗。

⑼ 胶原酶的配置

胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌和储藏。
注意：
因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。
钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培养液配制。

⑽ 做完胶原酶消除骨刺的手术后两腿无力怎么办

没事的小伙子，你这是质增生术后常见问题，正常现像不用担心，有很多原因，可能坐骨神经有影响，多吃点B类维生素促进神经修复，好好休息啦，情况不见好转建议深入就医，别担心会好的