wb预制胶原理是什么

Ⅰ western的一抗有哪些都是什么，原理又是什么

做western时需要用到一抗和二抗，其中一抗的特异性要求很高，一抗有很多来源的，如鼠源、兔源等，现在很多生物试剂公司都有产品，选个质量有保证的比较可靠，一抗与目的蛋白（抗原）结合后连接牢固，再用TBS洗脱非特异性结合的抗体，再加二抗孵化，再洗脱，二抗一般用碱性磷酸化酶或者辣根过氧化物酶标记，这样待检目的蛋白就偶联上一抗——二抗——标记酶，最后再用发光液作为酶底物反应，在暗室中即可看见信号强弱不同的荧光，再用胶片曝光就得到了western最终结果

Ⅱ wb实验的原理和步骤

WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上，再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。
清洗玻璃板:清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时对齐，以免漏胶。
10%分离胶的配置:混合摇匀(用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡)
灌胶：沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶(用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡)保持液面平稳上升至上方绿色线为止
水封：立即用1ml超纯水进行水封(利用重力把胶压平)，如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min。
浓缩胶的配制(5%)。

Ⅲ western blot中封闭起什么作用

转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。

在做Western blot实验中，会用到固相载体(如NC膜，PVDF膜)，在这些固相载体表面有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。

蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。

(3)wb预制胶原理是什么扩展阅读：

封闭液中的蛋白可以与固相载体表面的空白位置结合，以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上，填补和覆盖蛋白结合位点以避免非特异性结合。同样，这两种作用使封闭液中的蛋白能够狠牢固结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。

封闭液应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白，不结合靶蛋白表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。

转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。

Ⅳ western blotting转膜是根据什么原理

原理：
western
blotting转膜一般采用“滤纸-凝胶-膜-滤纸”夹心法，凝胶靠近负极，膜靠近正极。
因为蛋白上结合有sds，因而带负电，在电流的作用下会从负极向正极运动，从而转移到膜上。
希望能帮到你！

Ⅳ wb实验的原理和步骤

WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上，再以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原。

与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。

WB 中常见的问题以及处理办法。

一、信号强度低

信号强度低是指在正常曝光条件下得到的目的条带微小或是没有目的条带，而增加曝光时间又会招致背景高、杂带多等问题。扫除试剂质量、操作失误等方面的影响，这一类问题产生的主要缘由如下：

① 样本蛋白表达量缺乏。倡议添加蛋白表达量较高的细胞系作为阳性对照，或是恰当增加上样量以取得较高程度的信号；

② 蛋白质降解。在蛋白样品制备期间留意蛋白酶抑止剂 PMSF 的运用，所制备的样品尽快检测或妥善保管；

③ 蛋白的转膜。运用恰当孔径的膜，同时优化转膜时间，关于高分子量蛋白可能需求更长的转膜时间。

④ 抗体的运用。抗体的反响种属与实验类型需求可以满足实验的需求，此外，抗体的稀释比、孵育时间等问题也需求在实验中不时优化；

⑤ 蛋白与抗体分离率低。减少洗膜次数或缩短洗膜时间，降低洗膜液中 NaCl 浓度等；

⑥ 抗原被封锁液遮盖。换用不同的封锁液，优化封锁液中蛋白质浓度并缩短封锁时间；

⑦ 甲醇浓渡过高。会招致蛋白质与 SDS 别离，并沉淀在凝胶中，同时使凝胶收缩或变硬，从而抑止高分子量蛋白的转移。实验中可恰当降低甲醇浓度或者运用乙醇、异丙醇替代。

二、非特异性条带或条带位置不对

WB 结果中目的条带之外的条带被称为非特异性条带，有时非特异性条带很明显，却没有目的条带，这些状况对结果剖析会产生很大的干扰。普通来说惹起这类问题的主要要素有：

① 抗体的非特异性分离。通常以为，多抗的特异性不如单抗，更容易产生非特异性条带，而恰当降低抗体的浓度有助于减少杂带。同时为了扫除二抗非特异性分离的可能，倡议设二抗阴性对照；

② 样品蛋白量过高。恰当降低上样量，同时延长洗濯时间与封锁时间可防止蛋白量过高对实验结果的不良影响；

③ 蛋白质降解。会招致条带位置变化并产生更多杂带，倡议采用新颖制备的或是冻融次数较少的样品；

④ 细胞传代次数过多。会招致蛋白表达形式的分化，倡议运用原始或传代少的细胞株；

⑤ 蛋白存在复合物。有的目的蛋白会和其他蛋白分离构成复合物，招致条带位置改动，需求查阅相关文献来肯定蛋白能否会构成稳定复合物；

⑥ 蛋白存在剪接体或多种修饰方式。局部蛋白存在剪切位点，有的剪切体具有免疫活性，在 WB 中也会被检测出。此外有的目的蛋白会存在糖基化位点或其他修饰位点，条带大小可能会远超理论分子量。因而需求查阅文献或是 uniprot 来得知蛋白的剪切体大小以及修饰位点等。

三、背景过高

在局部 WB 结果中，条带之外本应是空白的背景也会有较深的颜色，对剖析结果会产生干扰，而且结果图不美观，难以用于文章发表。这种问题的可能缘由有以下几点：

① 封锁不充沛。背景过高的主要缘由之一是封锁有问题，倡议运用适宜的封锁剂（脱脂奶粉、BSA 等），优化反响浓度与封锁时间，同时留意防止呈现抗体与封锁剂的穿插反响，以及封锁剂与含有目的抗原，内源性生物素或者与抗生物素蛋白/链霉亲和素不相溶等问题；

② 洗膜不充沛。恰当增加洗膜次数弛缓冲液体积，进步吐温20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的问题；

③ 抗体的运用。一抗浓渡过高是高背景的缘由之一，且二抗也存在与封锁剂非特异性分离的可能，因而倡议恰当优化一抗浓度，并设二抗阴性对照；

④ 曝光时间长。倡议在实验中采用适宜的曝光时间。

四、条带弥散或外形怪异

有时 WB 结果图中条带位置契合预期，但却由于条带弥散、外形怪异等要素招致无法运用，呈现这种状况多半是制胶或电泳过程出了问题，详细如下：

① 电泳时电压、电流过高。会招致条带迁移速率过快以及 SDS-PAGE 温度升高，并可能使得条带弥散、外形变形。倡议运用适宜的电泳条件并坚持低温；

② 电极不均衡。会招致条带偏斜，上样时在无样品的胶孔中参加等量样品缓冲液可防止这种状况；

③ 上样量过高，样品中盐离子浓度较大。上样量过高可能会招致条带弥散，样品中的盐离子浓度不分歧则会招致条带不齐等问题。因而在上样时需保证样品量分歧且恰当，并坚持相同的、较低的盐离子浓度。

④ 制胶问题。在配胶时一定要保证充沛混匀，平均凝胶，上样前用针头将胶孔拨正并吹出胶孔中的气泡。

⑤ 电泳缓冲液寄存过久。电泳实验中的缓冲液假如放置过久也会对结果有不良影响，因而倡议及时改换新的缓冲液。

五、膜上分布不平均的污点

有时在 WB 做出结果后，除了目的条带以外，膜上还散布着不规律的污点，对结果也会有较大的干扰。这类问题产生的主要缘由有以下几点：

① 试剂、仪器等污染。倡议在每次实验前后留意清算实验仪器，同时及时改换呈现问题的试剂；

② 转膜时有气泡。确保在转膜过程中将气泡扫除洁净；

③ 抗体孵育时与膜接触不充沛。确保在抗体孵育过程中，液体总量足够，同时将抗体平均配置，并在摇摆的条件下停止孵育；

④ 曝光时间。过度曝光会招致斑点更明显，倡议采用适宜的曝光时间；

⑤ 膜枯燥。实验中要保证有充沛的反响液，防止呈现干膜现象。

Ⅵ SDS-PAGE和western-blot有区别吗

前一个只是把蛋白进行电泳分析，主要用于蛋白纯度分析及分子量分析，主要用于定性；后者则是在前者的基础上又经过了转膜及杂交等步骤，用于分析特定蛋白的表达多少的。

Ⅶ westernblotting转膜是根据什么原理

western blot中封闭主要是起去除非特异性吸附的作用
在western blot转膜时，PVDF膜在甲醇活化后是带电的，因而在转膜时会将蛋白吸附。封闭的目的就是要将PVDF膜上无蛋白的部分空隙用奶粉填满，以免孵抗体的时候一抗二抗与之结合，产生非特异条带或者是背景杂乱。
所以western blot中封闭主要是起去除非特异性吸附的作用

Ⅷ 关于小分子蛋白的Western-blot问题，实验时的胶浓度，电压，转膜条件等等

我最小也只做过十几KD的。但是根据原理呢主要有以下注意事项：

1。当然是胶的浓度。9kda的话要适当增大，15-20%应该差不多吧。如果实在不行还能考虑用gradient gel。

2。二是转膜缓冲液，内要含20%甲醇，新鲜配制，反复使用的话注意甲醇会蒸发掉。如果连续使用的话两三次应该还可以。甲醇一是能够洗掉跑胶时泡透了的SDS(SDS使蛋白带负电，方便移动)，二是帮助蛋白固定到膜上面。它同时有收缩胶的孔径的副作用，但对小分子无影响。
3。三是膜的孔径。很多常规的膜孔径为0.45um。你如果做小分子，17kd以下都跑掉了，那你应该试试0.2um孔径的膜。有一个小诀窍是转膜时叠两张膜一起转，如果小分子蛋白跑过了前面一张膜，那总还有可能被后面一张膜抓到。
4。四是转膜时间。小分子的话就不要过夜转，采取100V一小时应该就可以了，注意降温。