消化脂肪的胶原酶怎么配置

① 请教：常用的内皮细胞培养基

上皮细胞培养1)表皮细胞培养1.取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块,以角化层薄者为佳,早产流产儿皮肤更好,切成0.5～1 平方厘米小块.2.EDTA 处理：先置入0.02%EDTA 中室温置5 分钟.3.冷消化：换入0.25%胰蛋白酶中,置4℃过夜.4.分离：取出皮肤,用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开.5.温消化：取出表皮单独处理,用剪刀剪成更小的块后,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化30～60 分钟.6.用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液.7.培养液：通过80 目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清,制成细胞悬液,接种入碟皿中,CO2 温箱培养.2) 乳腺组织培养直接培养法：(适于培养含纤维少的软组织)1.在含有少量培养液或Hanks 液的容器中,用锋利刀片将组织反复切割成碎块.2.把组织碎块连同液体注入离心管中,再补加少许培养液,用吸管吹打片刻,置试管架3～5 分钟.吸除上层液可排除非乳腺细胞部分.重复2～3 次.3.末次处理结束后,向沉降管中再补加培养液,用吸管稍吹打,使沉降物重悬.不待细胞团块下降立即通过3～4 层无菌纱布滤入另管中.4.调整好适宜密度,接种入培养瓶中培养.胶原酶消化法：(适于处理含纤维多的较硬组织)其过程与培养其它组织相同.3) 胃上皮细胞培养1.取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许.2.清洗：用含庆大霉素(400 微克/毫升)和二性霉素(2 微克/毫升的Hanks)液漂洗后,用钝器剥离下粘膜,剪成1mm3 大小.3.消化：在I 型胶原酶和透明质酸酶中,于37℃中消化80 分钟.4.离心：收集细胞悬液,800 转/分离心后,Hanks 液漂洗两次.5.接种：末次离心后加入含有1%～2%胎牛血清的完全培养基,接种入不同孔数的培养板中,接种量依不同实验目的而定.4) 肝细胞培养初代组织块培养：取新鲜肝脏,先剥除被膜和血管等纤维成分,用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3 左右的小块,采用帖壁培养法.初代消化法培养：1.把肝组织切成2～4 立方毫米的小块,用不含钙镁的BSS 液洗两次.2.移入1：1 的0.1%胰蛋白酶和0.1%胶原酶(都用无钙镁BSS 配置)中,4℃冷消化10～12 小时后,通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过.3.收集细胞、BSS 液洗1～2 次、计数、接种培养.消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法(肝脏灌流需用全肝,以较小动物如小鼠和大鼠为好)：1.无菌解剖动物,取出肝脏,先用BSS 洗除血污.2.取5ml 注射器一支,吸取消化液后,把注射器头轻轻插入肝管中,用线绳结扎牢固,以防消化液漏出,轻轻把消化液注入肝管系统,并不时轻揉压肝脏,以便消化液进入肝小叶中;消化液在肝内停留20～30 分后,在吸出消化液的同时并轻揉压肝脏,以使肝细胞脱落和消化液吸出.3.待吸净消化液后,注入离心管中,低速离心分离,用RPMI 1640 培养基培养(较其它培养基为好),能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果.传代培养：待细胞生长连接成片后,用BSS 洗一二次,加1：1 的0.025%胰蛋白酶和0.02% EDTA 混合消化3～5 分钟,待细胞回缩,便停止消化,弃掉消化液,用BSS洗一二次,注入营养液,吹打,制成细胞悬液,再接种培养.5)内皮细胞培养1.取产后的新鲜脐带.如不立即培养可以保存于4℃中,但不宜超过12 小时.无菌剪取长10～15 厘米一段.其它如胚胎和幼体动物的大血管,亦可用于培养.2.先用三通注射器吸温PBS 液注入脐带的静脉中,洗除残血,注入口处宜用线绳结扎,以防液体返流.3.用血管钳夹紧脐带一端,从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1%的胶原酶,待末端出现液体后结扎之,令充满血管,注入口亦应结扎,以防液体返流,消化3～10 分钟.4.吸出含有内皮细胞的消化液,注入离心管中,为获取更多细胞,可再注入温PBS 冲洗2～3 次彻底清除干净残余细胞,一并注入离心管中离心.5.吸除上清,加1640 培养液,制成细胞悬液,接种入瓶皿中培养,顺利时2～3 天内细胞即可长成单层.6)毛细血管内皮细胞培养肿瘤条件培养基制备：1.取C3H 小鼠的S-180 实体肉瘤组织.2.胰蛋白酶消化,Dulbecco 改良Eagle 氏培养液15ml(含10%小牛血清),接种到T-75 Falcon 产培养瓶中培养.3.在细胞生长接近完全汇合时,收集培养液制成条件培养基;再用含10%小牛血清的新培养液后,也每隔两天收集一次,可获得多量条件培养基.4.4000 转/分离心后,再通过0.22μm 微孔滤膜滤过,-20℃冻存备用(临用前融解).初代培养：1.取材：取新鲜牛肾上腺数个,先用Hanks 液洗除血污.2.剥除被膜,分离出皮质,切成1 立方毫米小块,加0.5%胶原酶室温中消化1 小时,每隔10 分钟用吸管吹打悬液令消化充分.3.通过不锈钢纱网滤过,网眼要求只允许能通过小于110 微米长的毛细血管小段.4.650rpm,4℃,离心7 分钟后,弃掉上清胶原酶.5.沉淀物用培养液重悬并离心,再重悬,再离心,共两次.6.末次沉淀物仍用含有10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle 氏培养液重悬后,稍吹打.7.接种于铺有明胶底层的培养皿中,37℃培养,在培养头1～3 小时中,毛细血管小段和内皮细胞最先帖附于底物上,而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮.8.趁此时,吸除培养液,再加入肿瘤条件培养液,每两天换液一次.毛细血管小段一般成自1～4 个内皮细胞,以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛,能持续2～5 天.毛细血管内皮细胞分离培养：1.初代培养2～3 天后,镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛,在培养皿背面,用不脱色笔划圈圈起.2.镜下检查,如圈内残有非内皮细胞时,可用显微细针在倒置显微镜下挑除.此操作用细胞解剖器或用手操作均可,宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行,但时间不宜过长(15～20 分钟),圈内非内皮细胞可用无菌胶刮除.3.用培养液漂洗两次,以去除漂浮细胞.4.剩余内皮细胞岛如小(5～20 个细胞)而少时,生长增值变得缓慢或不完全不生长,此时需加入3T3 等饲细胞,饲细胞接种量为4000 细胞/cm2.5.当内皮细胞充满所有饲细胞空间后,用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基.6.接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡淘汰),细胞增殖生长汇合后,按1：5 传代.

② Collagenase D是否就是Collagenase IV

胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶的化学本质是一种蛋白质，因此，这对温度、PH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感，极易受到外界条件的影响而改变其本身的构象和性质。 胶原酶按其存在的方式不同可分为人体内源性胶原酶和药用胶原酶两种。人体内源性胶原酶是指人体内部本身所具有的胶原酶，如牙龈、触膜等上皮组织和关节滑膜、椎间盘内都不同程度的存在着这种胶原酶，它在体内胶原蛋白的分解过程中发挥着不可或缺的作用。药用胶原酶是指利用生物制药的高科技手段从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵液中提取、纯化并精制而得的白色或类白色无菌冻干粉针生物制剂。 胶原酶（collagenase）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。 胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。常用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%~0.3%。胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。 1、胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细 胞，用于哺乳动细胞的分离。 2、胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它能消化多种组织。 3、胶原酶Ⅴ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它可用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。 4、胶原酶Ⅱ适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织。 胶原酶的配置 胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌和储藏。 注意： 因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。 钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培养液配制。 胶原酶的使用 1.将漂洗、修剪干净的组织剪成1~2mm3左右小块 2.将组织块放入离心管（三角烧瓶）中加入30~50倍体积的胶原酶溶液，旋紧盖子（密封烧瓶）。 3.将烧瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱内，每隔3min振摇一次，如能放在37℃的恒温震荡水浴箱中则更好。 消化时间与组织的类别很有关系，对于某些肿瘤组织或其他较致密结缔组织，消化时间4~48h，对于容易消化的组织可以采用37℃震荡消化15~45min，也可以根据具体情况而定。如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分。上皮组织经胶原酶消化后，由于上皮细胞对此酶有耐受性，可能仍有一些细胞团未完全分散，但成团的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此，如无特殊需要可以不必再进一步处理。 4.收集消化液（有时含个别组织块及没有充分消化的组织碎屑则需用100目不锈钢网过滤），离心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者无血清培养液离心漂洗1~2次，去除上清，加培养液制成细胞悬液，接种培养瓶。

③ 哪位做过脂肪细胞原代培养

方案 23.12 脂肪细胞的原代培养

实验材料

DMEM-ADMEM-B胶原蛋白酶雄性 Sprague-Dawley 大鼠

试剂、试剂盒

KRBH缓冲液KRBH-A缓冲液

仪器、耗材

Petri培养皿锥形离心管聚丙烯管低密度聚丙烯瓶尼龙滤网尖解剖剪Perry镊塑料箱铡刀移液器

实验步骤

一、切除附睾脂肪垫

1. 在充有 70 % CO2和 30 % O2混合气体的塑料箱内麻醉大鼠（雄性 Sprague-Dawley 大鼠：145~170 g，CD 系（Charles River Breeding Laboratories）。

2. 用铡刀断头放血。

3. 将鼠体在 70 % 乙醇内浸泡一会儿。

4. 尽量在无菌条件下切除附睾脂肪垫。

(a)用一把解剖剪剖开下腹部皮肤，暴露腹膜。

(b)用另一把解剖剪剖开腹膜，然后用 Perry 镊向上牵拉睾丸。

(c)剪取附睾脂肪垫，注意保留血管。

5. 将组织移送到培养实验室。

脂肪细胞的胶原蛋白酶（在 2 ml KRBH 缓冲液加入 20 mg/ml 胶原蛋白酶，然后用 0.22 μm 滤器过滤）消化和洗涤

6. 将 4 g 脂肪垫（相当于 8 个附睾的脂肪垫）放入盛有 4 ml KRBH 缓冲液 （Krebs-Ringer 液，pH 7.4，添加 10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES（Sigma）、200 nmol/L 腺苷（Boche）和 1 % BSA （W / V，Intergen）。配制 1 L KRBH 缓冲液时，用 7 g NaCl、0.55 g KH2PO4、0.25 g MgSO47H2O、0.84 g NaHCO3、0.11 g CaCl2、7.15 g HEPES、10 g BSA、1 ml 200 μmol/L 腺苷， 加超净水至 1 L。然后，按 100 ml 分装。使用前加热至 37°C，并将 pH 调整至 7.4。）（37°C）的 30 ml 低密度聚丙烯瓶内。

7. 将脂肪垫剪成直径约为 2 mm 的组织块。

8. 将组织块放入瓶内，然后加入 1 ml 胶原蛋白酶液。在 37°C 水浴振荡器孵育约 1 h，直至细胞混合物形成乳脂样浓稠液体。

9. 胶原蛋白酶消化后，向瓶内加入 4 ml KRBH 缓冲液（37°C）。

10. 通过搅拌混匀瓶内的细胞，然后用孔径为 250 μm 的尼龙滤网（孔径为 250 μm，放入支持物或漏斗内）将细胞轻轻滤入 50 ml 锥形离心管。

11. 通过向离心管内加入 30 ml KRBH 缓冲液（37°C）洗细胞。用台式离心机短时间离心（ 200 g），然后用吸管吸出下清液。注意脂肪细胞浮在水性缓冲液的上面。

12. 通过加入 40 ml KRBH 缓冲液洗细胞，离心，除去下清液。重复该步骤 1 次。

13. 用 40 ml DMEM-A （DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、200 nmol/L（R )-N6-（l-methyl-2-phenylethyl）腺苷（PIA，Sigma）、100 μg/ml 庆大霉素和 25 mmol/L HEPES。按 100 ml 分装，使用前加热至 37°C）（37°C）洗细胞 2 次。

14. 用约 40 % cytocrit DMEM-A 混悬漂浮的细胞。

二、脂肪细胞的原代培养

15. 用 200 μl 大口径吸头将 2 ml 40 % cytocrit DMEM-A 悬液移入 60 mm 培养皿。

16. 将培养皿放入湿润的培养箱，在 37°C 和 5 % CO2的条件下培养 1.5 h 。

17. 向培养皿内加入 5 ml DMEM-B（DMEM-A，添加 7% BSA）。

此时，应进行葡萄糖摄取实验 [ Quom 1998 ]，检査细胞的活力。

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中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6):443~446443

人前脂肪细胞的原代培养

王竹晨1,刘建中2,李??燕2,杨冬梓1,邝健全1

(中山医科大学??1.孙逸仙纪念医院妇产科,2.生物教研室,广东广州??510120)

摘??要:??目的 建立人前脂肪细胞原代培养方法,以更深入地研究人体脂肪组织增生的生物学特征。??方法 选用成人的腹部脂肪组织,采用原代消化细胞培养法培养出棱形细胞;同时取皮肤组织,进行成纤维细胞培养作为对照。??结果 培养出的棱形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高。经形态学动态变化的观察,生长曲线及油红O脂肪染色抽取法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞,并在体外重现了其增殖的全过程。??结论 在成熟的脂肪组织中存在着可分化成熟、生成脂肪的前脂肪细胞。由于脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,本实验为进一步研究与肥胖及胰岛素抵抗相关的疾病如多囊卵巢综合症等打下了基础。

关键词:前脂肪细胞;细胞培养;脂肪组织

中图分类号:Q254,R711.75??????文献标识码:A??????文章编号:1000-257X(2001)06-0443-04

WANGZhu??chen1,LIUJian??zhong2,LIYan2,YANGDong??zi1,KUANGJian??quan1

(1.,SunYat??senMemorialHospital,2.DepartmentofBiology,

SunYat??,Guangzhou510120,China)

Abstract:??Objective .??Methods Usingprimarycellculture,fibroblast??..??Results Thecellswerehighlyhomogeneous,.,growthcurve,,.Undercontrolledconditions,.??Conclusion Inmaturehumanadiposetissue,.,thisstudylaidthebasisforfur??syndrome.

Keywords:preadipocyte;cellculture;adiposetissue

????脂肪细胞是胰岛素作用的经典靶细胞之一,与

肥胖及胰岛素抵抗相关疾患如多囊卵巢综合症的

研究关系密切,近年来受到妇科内分泌领域的重

视。前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分

化能力的特异化的前体细胞,它的存在和作用持续

于人的一生,我们从人脂肪组织中培养出了前脂肪

细胞,为进一步研究打下了基础。

????收稿日期:2001-04-23

????基金项目:广东省卫生厅科研基金资助课题(2001189)

????,;1??材料与方法1.1??组织来源选取2000年9月~2001年1月本院妇科内分泌病房行输卵管复通术的正常体重患者。年龄20~40岁,身体健康,无其他急慢性疾病。术中开腹时切取皮下脂肪组织及皮肤组织。

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1.2??试验材料

1.2.1??主要试验用品和化学试剂??DMEM/F??12培养基(1!1),无支原体胎牛血清,?型胶原酶,Hepes,人转铁蛋白,青、链霉素原液均购自GIBCO公司;生物素、泛酸盐、氢化可的松,三碘甲状腺原胺酸(T3),3??异丁基??1??甲基黄嘌呤均系SIGMA公司产品。牛血清白蛋白购自Roche公司。试验所需无机试剂购自广州市医药公司化试批发部,均系分析纯试剂。培养瓶购自KORNING公司。

1.2.2??培养基及主要试剂的配制??培养基A[1]中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6)培养基A制成细胞悬液,接种至25cm2培养瓶内,密度为每平方厘米3?10个细胞,置37#,体积分数5%CO2培养箱内孵育16h后,PBS轻轻洗去培养瓶内未粘附的物质,换用培养基C诱导和维持脂肪细胞分化,3d后更换为培养基B,以后每2~3d更换一次培养基B。1.3.2??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的组织学染色??盖玻片剪成0??5cm?1??0cm大小,接种时置入培养瓶内,待细胞贴壁后每2、3d从培养瓶内取出染色。将贴有脂肪细胞的面朝上,浸入体积分

数为10%甲醛的等渗盐缓冲液中固定10min,然后放入PBS缓冲液中,轻轻漂洗片刻,直立使残留水份流到边缘,吸水纸吸掉。稍干燥后,人前脂肪细胞采用苏丹%??&滴染法及Mayer苏木素复染细胞核,甘油明胶封片;皮肤成纤维细胞采用常规苏木素-伊红染色,脱水透明后中性树脂封片,光镜观察并拍照保留结果。

1.3.3??细胞生长曲线的绘制??将细胞悬液等量接种至24个培养瓶内,随机分成8组,每组3瓶,每2d检测一组中每个瓶中的细胞总数,取3个瓶的均值,如此至第8组结束。细胞计数方法参照医学细胞生物学实验[3]。

1.3.4??油红O染色提取法测定细胞内的脂肪含量??接种方法同1.3.3,根据Ramirez[2]4:按说明取DMEM/F??12培养粉5g,加入胎牛血清使其体积分数为10%,三蒸水定容至500mL;培养基B:按说明取DMEM/F??12培养粉10g,加入终浓度分别为15mmol/LNaHCO3,15mmol/LHep??es,33??mol/L泛酸盐,17??mol/L人转铁蛋白,100000U/L青霉素,0??1g/L链霉素,100nmol/L氢化可的松,60nmol/L胰岛素,0??2nmol/LT3,三蒸水定容至1000mL;培养基C:取培养基A200mL,加入3??异丁基??1??甲基黄嘌呤,使其终浓度为0??25mmol/L;消化液:称取胶原酶(?型)150mg,牛血清白蛋白2g,0??01mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)定容至100mL;红细胞溶解缓冲液:称取适量NH4Cl,K2HPO4和EDTA,使其终浓度分别为154mmol/L,5??7mmol/L,和0??1mmol/L,三蒸水

定容至250mL。上述溶液均经调整pH值至7??4~7??6,0??22??m微孔滤膜正压过滤除菌,分装后置-30#保存。油红O工作液[2]等的方法测定。培养物用体积分数10%甲醛的等渗盐缓冲液固定1h后,蒸馏水漂洗。吸取油红O工作液10mL,使培养面向下浸染,2h后倒掉瓶内的油红O

工作液,蒸馏水漂洗培养瓶数次,直至完全漂浮干净。将已染色的培养瓶置于32#孵箱内蒸发掉瓶内的水份后即加入1mL异丙醇,萃取出的染液即刻用吸管移出,于HITACHIG2000型分光光度计510nm波长处测吸光度。:称取4??2g油红O溶于1200mL异丙醇中室温静置过夜,分析滤纸过滤后收集滤液,并加入900mL三蒸水,于4#再次静置过夜后过滤两次即可于室温贮存备用。1.2.3??仪??器??CO2培养箱,倒置显微镜等。1.3??方??法

1.3.1??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的原代培养[1]??术中切取脂肪组织约60g,同时切取皮肤组织约0??5cm?3cm进行成纤维细胞培养作为对照。PBS洗涤,分离去除脂肪组织中肉眼可见的纤维成份及血管,皮肤组织则需去除表皮和皮下脂肪,剪碎成约2mm?2mm的小块,加入消化液,置37#,体积分数5%CO2培养箱内消化。15h后,200?g短时离心,去除漂浮的脂肪细胞及培养液,沉积的细胞用红细胞溶解缓冲液再次配成细胞悬液,37#孵育10min,以去除污染的红细胞,150??2??结??果2.1??原代培养的人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞形态学观察细胞贴壁后初为小圆形,核/浆比例较大(图1??1),4d即可观察到细胞渐成梭型,7d左右此棱形细胞大量繁殖,面积达到培养瓶底1/2之后开始积聚脂肪颗粒(图1??2)。9d可观察到细胞由棱形渐变成椭圆形或圆形(图1??3),积聚有脂肪颗粒的

第6期??王竹晨,等.人前脂肪细胞的原代培养445肪细胞(图1??4)。体外培养的脂肪细胞体积较大,细胞膜较薄,膜轮廓不光滑,凹凸不平有皱折,胞质内有大量圆形脂滴,大小不等且多散在,也有小脂滴大量触合成大脂滴的情况,核仍位于边缘,而同时培养的皮肤成纤维细胞增殖速率相似,但始终为长棱形,无脂滴积聚(图2??1,图2??2)。

2.2??人前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞的生长曲线

由生长曲线可见人前脂肪细胞(图3??1)和皮肤成纤维细胞(图3??2)的倍增时间分别为60h和55h

。3??讨??论3.1??人前脂肪细胞培养在妇科内分泌领域的研究意义脂肪细胞是脂肪组织的重要组成部份,也是其发挥功能的主体。当代研究认为脂肪组织中脂肪细胞非常活跃,细胞的数目,形态及细胞内脂肪的含量均处于动态变化之中,并保持终生。肥胖症被认为是脂肪细胞增殖和分化失控的结果。目前,肥

胖已成为与妇科内分泌领域密切相关的疾病,肥胖可产生胰岛素抵抗/高胰岛素血症,而胰岛素抵抗/高胰岛素血症是许多临床疾病或病症,尤其是常见的内分泌代谢性疾病如糖尿病、高血压和动脉粥样硬化等的共同危险信号,因此成为近年医学多学科共同感兴趣的研究热点。特别是近年的研究发现

图3.1??人前脂肪细胞生长曲线

Fig.3.1??

culture胰岛素抵抗/高胰岛素血症还与育龄妇女高雄激素血症及无排卵有关。临床常见的多囊卵巢综合症,

生育年龄妇女中约有5%~10%患者此症,常伴有肥胖,病因不明。目前认为多囊卵巢综合症即是以胰岛素抵抗为特征的内分泌代谢性疾患,继发于胰岛素抵抗的高胰岛素血症对造成高雄激素征象起着重要作用,并致不孕[4]。脂肪细胞作为对胰岛素

图3.2??人皮肤成纤维细胞生长曲线

Fig.3.2??敏感的靶细胞之一,因此对其潜在胰岛素抵抗机制的研究具有特殊临床意义。体外前脂肪细胞培养

能完整地认识脂肪组织的发生和增生的全过程,并且可以直接观察各种因素对这个过程的调控,研究其机制,是研究脂肪组织的理想模型。国外虽已建立了来源于鼠的前脂肪细胞的细胞株如3T3??L1、3T3??F442A,ob17系列等,但到目前为止,尚未见有人的前脂肪细胞株建立[5],因而使进一步的研究受到了限制。

3.2??体外培养的人前脂肪细胞的生物学特性

目前国内外前脂肪细胞体外培养系统大致有两类,一类来源于血管基质组份细胞(stromalvas??cularfraction,SVF),这是经典的前脂肪细胞。Van等[6]对SVF的系统研究形成了完整的前脂肪细胞理论。他们将切下的脂肪组织用胶原酶处理,再将组织悬液离心,其中的沉淀物基质血管成份即是SVF,将其SVF进行培养,和培养的成纤维细胞比较,这两种培养物以差不多的速率增殖,倍增时间约55h左右。在显微镜下比较细胞,发现起初2.3??前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞生长过程中细胞内脂肪含量的变化前脂肪细胞内的脂肪含量于培养9d后迅速增加,16d左右到达高峰,而皮肤成纤维细胞内仅有极少的脂肪积聚(图4)

。图4??前脂肪细胞及皮肤成纤维细胞生长过程中细胞内脂肪含量的变化Fig.4??lture

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可积聚大量脂滴,而成纤维细胞的胞浆内则无或只有少量的脂滴。这就证明了SVF是具有增殖和向脂肪细胞分化潜能的前脂肪细胞。本实验研究结果与之相符,符合文献中提出的3个标准[6]。此外,近年还有人报道采用脂肪组织块贴壁和天花板培养相结合的方法也获得了成功[7]。此种方法得到的前脂肪细胞与SVF不同,可能来源于Carraro等发现的成熟脂肪细胞内都有的一种细胞岛[8]。但此种方法是采用有血清培养并且与成熟脂肪细胞共同孵育,不适于作为成熟脂肪细胞所分泌的某些细胞因子的体外研究模型。

前脂肪细胞的培养阐明了其增殖和分化的关系,目前认为这是一种生长停顿?生长再续?细胞分化的连续关系。生长停顿是必要的第一步,此后这些细胞至少进行一次以上的再分裂,才继续向成熟脂肪细胞转化。并随时间的推移出现甘油??3??磷酸脱氢酶(GPDH)mRNA这个晚期标志物,这也是脂肪合成所必需的限速酶,并最终变成脂肪细胞。我们的研究也观察到细胞贴壁后经过一段时间的潜伏期后开始生长,3、5d左右大量增殖,1周后开始有脂肪颗粒的积聚。培养2周时,分化成多脂滴或单脂滴的脂肪细胞,与文献报道一致。

油红O染色提取法可简便、快速地对体外培养的前脂肪细胞转化率进行定量。文献报道其准确性和敏感性与测定前脂肪细胞分化过程中的标志酶GPDH相似[2]。因此常用来作为对体外培养的前脂肪细胞进行鉴定。体外培养的前脂肪细胞在胰岛素、氢化可的松等的作用下,GPDH即开始上升并迅速增加,8d左右达到高峰并维持在高水平[2]。我们采用油红O染色提取法进行研究,结果表明,前脂肪细胞在培养第3天即开始有脂肪的积聚,1周后积聚量明显增多,2周时达到高峰,与形态学上的培养1周后细胞内开始出现脂肪颗粒相吻合。并说明酶的出现在先,脂肪出现在后,细胞内脂肪含量的明显增加比GPDH的出现要晚1周左右,与文献报道相吻合[2]。

3.3??人前脂肪细胞培养技术的特点

脂肪组织来源于原始的网状结缔组织,由结缔组织和脂肪细胞组成,细胞成分中以脂肪细胞为主,此外还含有网状细胞,间充质细胞,组织细胞,内皮细胞等。脂肪细胞和成纤维细胞均来自中胚层,因此培养脂肪细胞和培养成纤维细胞具有相似[9]中山医科大学学报(AcadJSUMS),2001,22(6)外培养条件有差异[10],不同的是需要促脂肪形成因子的作用,目前已知的这类物质有:胰岛素、糖皮质激素、甲状腺素、生长激素、转铁蛋白,3??异丁基??1??甲基黄嘌呤,纤维粘连素等。培养基一般采用DMEM和F12按1!1比例配制,细胞数量适中,初次接种时细胞贴壁不十分牢固,动作要轻柔以免细胞漂浮。选用的取材对象越年轻越容易生长。人类一般选用外科手术切取腹部脂肪组织,如用注射器抽吸则易损伤细胞,降低成活率。(本文图1,2见插页2)参考文献:[1]HaunerH,PetruschkeTH,RussM,etal.(TNF??)??[J].Dibetologia,1995,38(7):764.[2]Ramirez??ZacariasJL,Castro??MunozledoF,kuri??Har??cuchW.??[J].Histochemistry,1992,97(6):493.[3]赵??刚,刘建中.医学细胞生物学实验与习题[M].北京:科学出版社,1999.35.[4]DunaifA.??drome[J].Endocrinol&MetabClinNorAm,1999,28(2):341.[5]BillingsE,MayJW.Historicalreviewandpresentsta????constructivesurgery[J].PlastReconstrSurg,1989,83(2):368.[6]VanRLR,BaylissCE,RoncariDAK.rsinculture[J].JClinInvest,1976,58(9):699.[7]朱晓海,何清濂,林子豪.人前脂肪细胞培养及增殖与分化模型的建立[J].中华整型烧伤外科杂志,1999,15(3):199.[8]CarraroR,LiZH,JohnsonJE.ntratadipocytes[J].CellTissRes,1991,264(2):243.[9]刘??清,邓漪平.内皮-平滑肌联合培养:细胞间相互作用对组织型纤溶酶原激活剂的影响[J].中山医科大学学报,1992,13(4):18.[10]朱永源,利天增,苏爱云,等.人表皮细胞的体外培养[J].中山医科大学学报,1998,19增刊:34.(??,)

④ 如何配置胶原酶2u/ml的胶原酶溶液，需要多少毫克胶原酶

梯度的配置一般高往低逐步稀释，一般现配一个大浓度的储备液你可以配1g/ml的，方法是称取100g的样品溶解后用100ml的容量瓶定容
50mg/ml的配置：量取5ml的1g/ml储备液稀释后，用100ml的容量品定容
40mg/ml：量取4ml的1g/ml储备液稀释后，用100ml的容量品定容
30mg/ml：量取3ml的1g/ml储备液稀释后，用100ml的容量品定容
,20mg/ml：量取2ml的1g/ml储备液稀释后，用100ml的容量品定容
10mg/ml：量取1ml的1g/ml储备液稀释后，用100ml的容量品定容
望采纳，谢谢

⑤ 胶原酶的配置

胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌和储藏。
注意：
因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。
钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培养液配制。

⑥ 肿瘤细胞消化液中胶原酶、透明质酸、DNA酶配合什么比例比较好胶原酶用哪个型的谢谢您的关注和回答

不同肿瘤组织 其中各种蛋白种类、比例各不相同，则相应消化酶的种类和比例也可适当改变，若要制备肿瘤悬液，个人推荐 先查找中英文文献，参考文献中的消化方法

⑦ 胶原酶的使用

1.将漂洗、修剪干净的组织剪成1~2mm3左右小块
2.将组织块放入离心管（三角烧瓶）中加入30~50倍体积的胶原酶溶液，旋紧盖子（密封烧瓶）。
3.将烧瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱内，每隔3min振摇一次，如能放在37℃的恒温震荡水浴箱中则更好。
消化时间与组织的类别很有关系，对于某些肿瘤组织或其他较致密结缔组织，消化时间4~48h，对于容易消化的组织可以采用37℃震荡消化15~45min，也可以根据具体情况而定。如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分。上皮组织经胶原酶消化后，由于上皮细胞对此酶有耐受性，可能仍有一些细胞团未完全分散，但成团的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此，如无特殊需要可以不必再进一步处理。
4.收集消化液（有时含个别组织块及没有充分消化的组织碎屑则需用100目不锈钢网过滤），离心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者无血清培养液离心漂洗1~2次，去除上清，加培养液制成细胞悬液，接种培养瓶。

⑧ 什么是胶原酶消化法

就是用胶原酶处理消化组织达到分离细胞的目的，所用胶原酶有不同类型：
1、胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，用于哺乳动细胞的分离。
2、胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它能消化多种组织。
3、胶原酶Ⅴ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它可用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。
4、胶原酶Ⅱ适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织

⑨ 谁知道0.2%Ⅱ型胶原酶和10%胎牛血清的怎么配制

每 100mg 胶原酶加入 50ml 培养液中 搅拌
均匀 用 0.2 微米 微孔滤膜过滤分装 -20 低温冰箱保存

450mlDMEM+50mlFBS

⑩ 胶原酶和胰酶在细胞原代培养中的区别

胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，作用对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。消化原代培养的上皮类细胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂.胰蛋白酶是一种胰脏制品,对蛋白质有水介作用,主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开,在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同,对细胞的消化能力也不同,胰蛋白酶对细胞的作用,取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等.

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶,对胶原有很强的消化作用.适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织,它对细胞间质有较好的消化作用,对细胞本身影响不大,可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害.该酶分离效果好,即使有钙、镁离子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培养液配制,即操作简便又可提高细胞成活率,最终浓度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用缓和,无需机械振荡,但胶原酶价格较高,大量使用将增加实验成本.