二型胶原酶怎么消毒

‘壹’ Collagenase D是否就是Collagenase IV

胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶的化学本质是一种蛋白质，因此，这对温度、PH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感，极易受到外界条件的影响而改变其本身的构象和性质。 胶原酶按其存在的方式不同可分为人体内源性胶原酶和药用胶原酶两种。人体内源性胶原酶是指人体内部本身所具有的胶原酶，如牙龈、触膜等上皮组织和关节滑膜、椎间盘内都不同程度的存在着这种胶原酶，它在体内胶原蛋白的分解过程中发挥着不可或缺的作用。药用胶原酶是指利用生物制药的高科技手段从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵液中提取、纯化并精制而得的白色或类白色无菌冻干粉针生物制剂。 胶原酶（collagenase）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。 胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。常用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%~0.3%。胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。 1、胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细 胞，用于哺乳动细胞的分离。 2、胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它能消化多种组织。 3、胶原酶Ⅴ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它可用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。 4、胶原酶Ⅱ适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织。 胶原酶的配置 胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌和储藏。 注意： 因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。 钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培养液配制。 胶原酶的使用 1.将漂洗、修剪干净的组织剪成1~2mm3左右小块 2.将组织块放入离心管（三角烧瓶）中加入30~50倍体积的胶原酶溶液，旋紧盖子（密封烧瓶）。 3.将烧瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱内，每隔3min振摇一次，如能放在37℃的恒温震荡水浴箱中则更好。 消化时间与组织的类别很有关系，对于某些肿瘤组织或其他较致密结缔组织，消化时间4~48h，对于容易消化的组织可以采用37℃震荡消化15~45min，也可以根据具体情况而定。如组织块已分散而失去块的形状，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可以认为已消化充分。上皮组织经胶原酶消化后，由于上皮细胞对此酶有耐受性，可能仍有一些细胞团未完全分散，但成团的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此，如无特殊需要可以不必再进一步处理。 4.收集消化液（有时含个别组织块及没有充分消化的组织碎屑则需用100目不锈钢网过滤），离心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者无血清培养液离心漂洗1~2次，去除上清，加培养液制成细胞悬液，接种培养瓶。

‘贰’ 胶原酶的配置

胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌和储藏。
注意：
因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。
钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培养液配制。

‘叁’ 我想查一下胶原酶的作用

胶原酶是人体内源性胶原酶是指人体内部本身所，具有的胶原酶如牙龈、触膜等上皮组织和关节滑膜、椎间盘内都不同程度的存在着这种胶原酶它在体内胶原蛋白的分解过程中发挥着不可或缺的作用。要补充胶原酶只要一点点辅助作用对腰间盘明显根本没有什么效果的

‘肆’ 细菌代谢产物中不易被高压蒸汽灭菌法破坏的是什么

热原质。
（pyrogen）即菌体中细胞壁的脂多糖，大多是革兰氏阴性菌产生的。注入人或动物体内能引起发热反应，故名热原质。
热原质耐高热，高压蒸汽灭菌（121℃，20’）不能使其破坏，加热（180℃ 4h;250℃45';650℃1'）才使热原质失去作用。热原质可通过一般细菌滤器，但没有挥发性，所以，除去热原质最好的方法是蒸馏。用离子交换剂和特殊石棉滤板也可除去液体中的大部分热原质。药液、水等被细菌污染后，即使高压灭菌或经滤过除菌仍可有热原质存在，输注机体后可引起严重发热反应。生物制品或注射液制成后除去热原质比较困难，所以，必须使用无热原质水制备。
外源性热原质，可以激活中性粒细胞和单核细胞。
细菌在其物质代谢过程中，除利用各种营养物质合成菌体和产生能量外，还可产生出多种代谢产物，其中有的对人和动物是有害的，有的可供鉴别细菌之用，有的可供制医药之用，现将有关的代谢产物分述如下。
（一）分解产物
1、糖分解产物 细菌分解糖类后，可以产生有机酸（主要为乳酸、醋酸、丙酮酸、酪酸等）、气体（主要为CO2、H2和沼气等）和醇类。
2、蛋白分解产物 细菌应用各种蛋白酶分解蛋白质，其最后产物包括有机酸、胺类、靛基质、硫化氢、硫醇、CO2和氢等。
（二）合成产物
这里所指的合成产物，是指菌体成分以外的其他合成物质。

1、毒素 病原性细菌可以合成各种有毒物质，称为毒素。毒素和细菌的致病作用有直接关系，它又分外毒素和内毒素两种。外毒素是蛋白质，内毒素则是糖、磷脂和蛋白质的复合物。
2、酶
细菌除合成其新陈代谢所必需的酶以外，还合成以下几种酶，这些酶在代谢过程中的作用尚不明了，但和细菌的致病性有一定关系。

①卵磷脂酶 此酶能分解细胞壁的卵磷脂，使细胞坏死或红细胞溶解，魏氏梭菌和水肿梭菌等含有此酶。
②胶原酶 此酶分解肌纤维的网状组织，使肌纤维发生崩解。杀鲑气单胞菌等含此酶。 ③透明质酸酶 此酶分解组织细胞间结合物质（结缔组织）的透明质酸，因而可增加组织渗透性，便于细菌和毒素的扩散。
④凝血浆酶 能使人、兔及马的血浆凝固，葡萄球菌中的金黄色葡萄球菌含有此酶，但白色和柠檬色葡萄球菌则不含有此酶，人们通常将此酶视为葡萄球菌具有毒力的指标之一。 ⑤溶纤维蛋白酶 使血清中的溶血浆素原活化，变为溶血浆素，因而使已经凝固的血浆或血块发生溶解。新分离的溶血性链球菌和葡萄球菌等含有此酶。
⑥溶血素 某些细菌产生一种能溶解动物红细胞的溶血毒素。溶血素也是一种酶类物质。如嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌和鳗弧菌等均可产生溶血素。
另外有的细菌还能合成明胶溶解酶和凝乳酶，可引起明胶液化和牛乳凝固现象。这些现象往往可以作为鉴定细菌的参考。
3、抗生素.
许多细菌、放线菌、真菌可以合成抑制或杀灭其他种微生物或肿瘤细胞的物质，称此物质为抗生素。例如青霉菌产生的青霉素、灰色链丝菌产生的链霉素、委内瑞拉链丝菌产生的氯霉素和金色链丝菌产生的金霉素等等。
4、维生素
某些种细菌和酵母有合成维生素的能力。一般认为大肠杆菌所合成的维生素是动物所需维生素的重要来源。
5、热原质
许多细菌，特别是革兰氏阴性菌，能在水中发育产生一种使人或动物发生热反应的多糖物质，称为热原质。
这种物质很耐热，甚至高压蒸气灭菌15～20min也不能将它破坏，但可被活性炭吸附或石棉板滤除。因此普通蒸馏水若在蒸馏后保存不当，就可能含有热原质，若注射到动物体或人体内，能引起发热反应。在制造化学注射药液或生物制品时，需要保证没有热原质存在。
6、色素
某些细菌在适宜的条件下能产生色素。其中有些溶于水，可使菌落及培养基着色。如杀鲑气单胞菌的褐色色素。有些不溶于水，但溶于酒精。故只能使菌落本身着色，例如葡萄球菌、八联球菌的色素。色素对于细菌的鉴别有一定价值，例如葡萄球菌的分型，按照其所产生的色素是分型的依据之一。

‘伍’ 鼠尾胶原蛋白I型，用那一种胶原酶可以溶解

醋酸就可以.

1．将胶原加入到0.1M 的醋酸中，制备成浓度为0.1%的溶液。在室温中搅拌1-3小时直到完全溶解。

2．建议将溶液转移到拧口的玻璃瓶中，并小心的在瓶底铺上一层氯仿。氯仿的量约为胶原溶液的10%。不要晃动或搅拌。在2-8度中放置过夜。在无菌条件下转移上层的胶原溶液。我们不建议用过滤的方法无菌化。已经发现该方法会导致丢失蛋白。

3．稀释一定数量的胶原溶液。

4．按照6-10ug/cm2的浓度包被培养瓶。在室温或37度结合数小时或者2-8度过夜。

5．从包被表面除去多余的液体。过夜干燥。如果胶原溶液不是无菌的，这时候可以在无菌细胞操作室中暴光在紫外线下过夜消毒。 在接种细胞前用无菌的水漂洗。

‘陆’ 胶原酶在4度冰箱放了一个月会失活吗

胶原酶4度存放，最好1~2周内用完；
长时间贮存宜在-20摄氏度，用前可放37度溶解，但溶解时间不能过久，防止酶活性受影响；
消化组织时间：取决于消化液浓度和组织类型，一般消化时间为2－3小时或者4度过夜。

‘柒’ 谁知道0.2%Ⅱ型胶原酶和10%胎牛血清的怎么配制

每 100mg 胶原酶加入 50ml 培养液中 搅拌
均匀 用 0.2 微米 微孔滤膜过滤分装 -20 低温冰箱保存

450mlDMEM+50mlFBS

‘捌’ 请教大鼠原代肝细胞的分离和培养的问题

我记得好像有这一方面的的论文，题目都一样的《大鼠原代肝细胞的分离与培养》是徐丽娜 鞠雷 顾宪锐 张恒 马玉忠 河北农业大学动物科技学院的
http://www.cqvip.com/qk/96216X/200712/26163977.html
你下载来看就行了（不过下载要钱）

下面我给你，我做的一个过程（仅做参考）
我做的就是大鼠原代肝细胞，养了一段时间了，下面是我的实验步骤，希望对你有所帮助。
1）3-5天乳鼠，断头处死，75%酒精浸泡3-5分钟。
2）移入超净台内，无菌取下肝脏，放入冷PBS内，撕下被膜等。
3）移入25ml烧杯内，剪成1mm3左右大小，PBS清洗至上清无色。
4）移入三角瓶内，加5倍量0.05%胰酶37度消化20分钟。
5）终止消化，静置，弃上清。加0.05%胶原酶消化20分钟。
6）100目过滤。离心，800，3分钟。
7）计数，调整浓度，接种。24小时第一次换液，以后没两天换一次液，4、5天可以铺满。

二、方法

1．传统门静脉灌流消化法（传统门脉灌流法）：参照邹氏等文献方法[3,4,5]。

2．低浓度胶原酶原位循环灌流法：

2.1取Wistar大鼠，用2%戊巴比妥钠10mg/100g体重、肝素20 u/100g体重分别腹腔注射以麻醉和抗凝。

2.2 10-15分钟后固定大鼠，75%酒精消毒，紫外灯照射15-30分钟。腹部再次75%酒精消毒后正中切开打开腹腔并更换器械。

2.3显露肝门部门静脉并游离2-3cm；显露游离肝下下腔静脉2-3cm，各置一结扎线，暂不结扎。

2.4穿刺针插入门静脉后立即结扎固定，尽快接通硅胶管并启动蠕动泵（无泵时，输液器亦可），同时剪断肝下下腔静脉远端。

2.5用D-Hanks液20-30ml/min快速灌注清除肝内血液，1分钟内即可见肝脏颜色变浅，持续灌注10分钟至肝脏呈米黄色。同时切开胸腔结扎肝上下腔静脉。

2.6插另一硅胶管入肝下下腔静脉并结扎固定，换D-Hanks液为胶原酶消化液(370C预热)循环灌注消化，灌流速度为10-20ml/min，持续时间10-20分钟至肝质变软，压之凹陷不易恢复。

2.7停止灌注，小心剪取各肝叶置入消毒平皿内，加入适量肝细胞洗涤液（4oC预冷），撕碎肝脏并祛除纤维结缔组织，制成混合肝脏细胞悬液。

2.8 100目筛网过滤入50ml离心管，500rpm离心1-2分钟。去上清，沉淀加入RPMI 1640 （4oC预冷）20-30ml洗涤3次。

2.9肝细胞沉淀加入肝细胞培养液重悬为10ml，取适量计数并用0.4%台盼蓝染色判断存活率。后即可按实验设计接种培养

我们目前正在做大鼠肝脏细胞的分离培养（原位循环灌注法），我把大体步骤和大家交流一下。
1，动物称重，戊巴比妥麻醉。
2，固定，消毒，腹部正中十字切口，或者“U”型切口进腹。
3，分离门静脉和肝下下腔静脉，分别插管，从门静脉注入肝素，使大鼠全身肝素化。
4，阻断肝上下腔静脉（位置较深，分离结扎有难度，可用哈巴狗血管夹夹住，亦可用消毒棉签压迫）
5，从门静脉内注入D-HANKS，直至肝下下腔静脉插管内流出来的液体中不含或含少量红细胞，肝脏呈米黄色。
6，此时接上自制的胶原酶循环灌注装置（循环通路：门--肝--肝下下腔--蠕动泵--门），灌注15分钟左右，到肝脏表面呈颗粒状为止。
7，取下肝脏，剪碎，去结缔组织，放入含有胶原酶的三角瓶中继续水浴消化10分钟后加入HANKS 或者1640终止消化。
8，将3角瓶带入超净台内，在超净台内完成以下步骤。
9，50目筛网，200目筛网，1640两次吹打过滤。获得细胞悬液。
10，1640洗涤离心3次，收集细胞，制成一定浓度的悬液。
11，计数，调整浓度，培养。

（大体步骤，太多细节不赘述，我们曾用此方法分离乳猪，大鼠的肝细胞，结果令人满意）

注意点：
1，腹部切口位置要合适，避免误入胸腔导致大鼠死亡。
2，插管要固定，避免滑脱。
3，阻断肝上下腔可以用小哈巴狗，但我们实际发现用下毒棉签压迫更为简单，效果也令人满意。
4，所有灌流液均要预热。
5，肝脏消化完毕后，立即拿到超净台内操作，注意无菌观念。
6，消化时间8宜过长。
7，组织块比较大，通过50目筛网有困难时，可用消毒注射器活塞轻轻挤压组织块，勿研磨！

优点：
1，消化充分，且节约胶原酶。胶原酶比较昂贵 ：）
2，在肝脏离体之前大鼠保持呼吸心跳，从而最大限度的保持了细胞的活力。
缺点：
需要一定的手术技巧，了解肝脏循环结构，且血管插管有一定难度。

‘玖’ Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶有什么区别

胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细 胞，用于哺乳动细胞的分离。
胶原酶Ⅱ适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织。

‘拾’ 胶原酶化学溶解术怎么样

胶原酶化学溶解术，是有很多优点的：

1. 可以达到根治椎间盘突出所致疾病的目的。胶原酶具有特异溶解性，可以溶解突出的椎间盘组织，解除其对神经根和脊髓的压迫。术后注意休息和康复锻炼，一般不易复发。

2. 安全性高。在CT引导下准确进入注射部位，不损伤神经、血管等重要结构。

3. 创伤小，痛苦小。不损伤骨质和韧带，保持了脊柱的完整性。操作中无痛苦。

4. 费用低廉，住院时间短。一般情况下，5～9天可以出院，减轻了患者的经济负担。

胶原酶化学溶解术，亦称胶原酶溶核术是在C型臂X线机、CT引导下，将胶原酶准确地注射到突出的椎间盘内及其周围，使突出的椎间盘溶解并吸收，解除其对神经根的压迫，达到与手术摘除椎间盘突出物同样的效果。优良率可达90％以上。由于该治疗方法创伤小，并发症少，疗效可靠，已成为治疗椎间盘突出所致的颈椎病、腰椎间盘突出症有效的微创介入治疗方法之一。

治疗原理

1. 胶原酶溶解术是将胶原酶注入病变的椎间盘内或突出物的周围，依靠胶原酶分解胶原纤维的药理作用来溶解胶原组织，使突出物减小或消失，以缓解或消除其对神经组织的压迫，从而使患者的临床症状得到改善。胶原酶是一种主要溶解胶原蛋白的酶，能有效地溶解髓核和纤维环中的Ⅰ型和Ⅱ型胶原，与人体组织渗透压相等的胶原酶溶液不破坏组织细胞和神经细胞，对血红蛋白、奶酪蛋白、硫酸角质素等蛋白无损害，能在正常的生理环境和酸碱度下分解胶原纤维，使其降解为相关的氨基酸并被血浆所吸收。

2. 将胶原酶注入病变的椎间盘内或突出物的周围，依靠胶原酶分解胶原纤维的药理作用来溶解胶原组织，使突出物减小或消失，以缓解或消除其对神经组织的压迫，从而使患者的临床症状得到改善，这种治疗方法称为胶原酶溶解术。

3. 椎间盘髓核组织主要由粘多糖、胶原蛋白构成，瑞典学者Carl Hirsch于1959年进行了木瓜凝乳蛋白酶，则无应用抗生素的必要。倘若在X线室及无消毒条件的CT室进行操作，患者体质情况又较差时，治疗后应当应用抗生素1周。因为一旦椎间隙发生感染或发生硬膜外腔感染，处理上较为棘手。预防的方法是在严格无菌环境下进行操作。