为什么血清不能终止胶原酶

㈠ 干细胞消化传代要注意哪些问题

一、贴壁细胞的消化 :
常用的消化方法主要有酶消化法、离子螯合剂、物理法和冷冻法。其中最常用的是酶消化法。
1、 酶消化法
贴壁干细胞酶消化传代时通常采用两种方式：1）、加入胰酶等干细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；2）、加入胰酶后，镜下观察待干细胞开始脱落时，弃去胰酶，加入培养液并分瓶。但前者太麻烦，而后者有可能对干细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的干细胞先脱落。
常用的消化酶有:
1）、胰酶 这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据干细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的干细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于干细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。
2）、胶原酶 这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下干细胞。这种方法作用温和，对干细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。

胰酶的质量是影响干细胞的消化的关键因素之一，如果配的比较标准，消化的时候就容易消化，反之就不易消化。还要在你看到消化过头的情况下，如果干细胞下来的比较多了，这时可以连同CMF或PBS加上营养液一起传。营养液中有血清，胰酶遇到血清就会自动终止消化，但这样操作对干细胞是有一定的影响的。
对于容易消化的干细胞，加入PBS缓冲液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将干细胞消化单细胞。

在此介绍一种简单省事并且效果好、不损失干细胞的方法：倒掉旧培养液，加入少量胰酶冲洗一下，倒掉，再加入0.125-0.25%胰酶约6-10滴或1ml（25ml bottle）消化，再加入适量新培养基中和并分瓶。

这里，胰酶消化的程度是一个关键：消化过度则对干细胞的活性损伤较大，并有部分干细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足则干细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤干细胞活性。 影响消化速度的因素较多，主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 。
2、离子螯合剂
离子螯合剂：不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测干细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。
1）、EDTA 用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显着影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度，它不能被中和。因此，消化下来的干细胞要洗一遍。
2）、商品化的无酶消化液 有些消化酶液对干细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。

对于较难消化的干细胞，可以用2%利多卡因消化5-8分钟，然后再弃去，加培养基吹打。或者是弃去培养液后，用0.04%的EDTA冲洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室温孵育5min，弃去大部分EDTA，加入与剩余EDTA等量的胰酶（预热）总体积1/10v。消化到有干细胞脱落。但大量使用EDTA对干细胞有损伤作用。也可以先用PBS把干细胞洗两遍，使瓶内没有血清了，减少对胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在少量干细胞消化下来时，拿着瓶口，运用手腕的力量轻轻震荡瓶内液体，这样干细胞很快就下来了，还不需要吹打，分散也均匀。
3、物理法：直接吹打或用细胞刮子将干细胞刮下来。
4、冷冻法：
此方法仅能用于细胞传代时无法使组织上的细胞脱落下来的情况。本方法的原理是因干细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。优点是：对干细胞损伤小，不需要中止或洗干细胞，方便，不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的干细胞。不足是干细胞常成小片脱落。此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。具体过程是：1）、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5ml/孔)，2）、再加0.5ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落，3）、轻轻吹打，细胞即完全脱落，4）、按一定比例传代。
消化时间和干细胞类型、消化液的消化能力、干细胞的密度等多种因素有关。干细胞消化过程要注意消化时间。一般养一种新的干细胞要摸索一下消化时间，掌握干细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强，配好后可分装成小管，一次用完，其余冻在－20℃，以保持酶活力。消化液只需铺满瓶底即可，可放入培养箱中，因外在37℃时酶的活力高于常温，有利于缩短消化时间。还有一种方法，就是将胰酶铺满瓶底后，轻摇培养瓶，使胰酶与干细胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待干细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可。细胞生长到覆盖70～80％瓶底时消化较好，若干细胞密度过大则消化后干细胞易成团。

消化时间不应超过5分钟，否则对干细胞损害很大。消化液覆盖干细胞，成一薄膜，然后反复倾斜，使消化液冲刷干细胞，当干细胞收缩，部分干细胞脱落时，可用完全培养基马上中和，同时吹打壁上干细胞。
在消化过程中经常出现细胞铺不开的问题，原因有二：一是消化时离心管中的细胞没有吹打开，解决方法是离心后的细胞加3ml左右的培养基，用吸管轻轻吹打，吹打开后，再加培养基，这样细胞不会成团，培养基太多，细胞不容易吹打开。二是接种时，培养瓶中先加培养基，再接种细胞，接种后轻轻晃动摇匀。先加细胞后加培养基或不晃动摇匀，其结果就是细胞铺不开。

二、 贴壁干细胞的传代扩增
贴壁干细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需要分瓶培养，对干细胞进行传代扩增。
对于贴壁不太紧的细胞，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的干细胞如CHO，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为：
• 将长成致密单层干细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去；
• 加入0.25％胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润；
• 一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化；
• 视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。

传代细胞培养注意事项：
1.严格的无菌操作 .
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养干细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

㈡ 细胞培养传代时终止消化用什么试剂

细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好
一、贴壁细胞的消化
:
常用的消化方法主要有酶消化法、离子螯合剂、物理法和冷冻法。其中最常用的是酶消化法。
1、
酶消化法
贴壁干细胞酶消化传代时通常采用两种方式：1）、加入胰酶等干细胞脱落后，再加培养基中止胰酶作用，离心传代；2）、加入胰酶后，镜下观察待干细胞开始脱落时，弃去胰酶，加入培养液并分瓶。但前者太麻烦，而后者有可能对干细胞施加胰酶选择，因为总是贴壁不牢的干细胞先脱落。
常用的消化酶有:
1）、胰酶
这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据干细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的干细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于干细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。
2）、胶原酶
这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下干细胞。这种方法作用温和，对干细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。
胰酶的质量是影响干细胞的消化的关键因素之一，如果配的比较标准，消化的时候就容易消化，反之就不易消化。还要在你看到消化过头的情况下，如果干细胞下来的比较多了，这时可以连同cmf或pbs加上营养液一起传。营养液中有血清，胰酶遇到血清就会自动终止消化，但这样操作对干细胞是有一定的影响的。
对于容易消化的干细胞，加入pbs缓冲液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），弃之，再加入适量胰酶作用10s-40s（根据细胞消化的难易程度），弃之，这样依赖残余的胰酶就可将干细胞消化单细胞。

㈢ 动物细胞培养中血清的作用和可能引发的问题是什么

血清主要作用：
●提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质.
●提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等.生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等.
●提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁.结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用.
●提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤.
●对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞,如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用.这种作用是偶然发现的,现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用.因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代.血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用.血清还含有一些微量元素和离子,他们在代谢解毒中起重要作用,如SeO3,硒等.

血清应用于细胞培养中的缺点：
成分不明确,血清保存期短,至多一年.不能排除血清中含有易变物质,使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态.血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞).血清含一些对细胞产生毒性的物质,影响细胞生长,甚至造成细胞死亡. 取材中可能带入支原体、病毒,对细胞产生潜在影响可能导致实验失败或实验结果不可靠性. 血清制作过程复杂、批间差异大成分不能保持一致使用使得实验和生产的标准化困难,其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成.

㈣ 去除纤维细胞后如何终止胶原酶消化

加点代血清的培养基。

㈤ 肝细胞培养

㈥ 胶原酶的配置

胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制、消毒灭菌和储藏。
注意：
因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。
钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培养液配制。

㈦ 为什么动物细胞的培养要加入血清

天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。
血清细胞培养的发展，培养基的质量又是关键，而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的，所以血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。保证血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。1．血清种类
目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。
牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。2．血清的主要成分
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展，但仍存在一些问题。主要是：第一：血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困难。第二：血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制。第三：不能排除血清中含有易变物质，这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。3．血清主要作用
提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。
提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。
提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。
提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。
对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3,
硒等。4．细胞培养中使用血清的缺点
血清成分复杂，虽含许多对细胞有利成分，也含有对细胞有害的成分，使血清有几个明显的缺点：
对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进某些细胞的生长（成纤维细胞）同时抑制另一类细胞生长（表皮细胞）。
血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。
动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。
取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。
血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。
大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。

㈧ 为什么动物细胞的培养要加入血清

天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等.组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培养基.但是由于天然培养基制作过程复杂,因此逐渐为合成培养基所替代.目前广泛使用的天然培养基是血清,另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少.
血清细胞培养的发展,培养基的质量又是关键,而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用.在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的,所以血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一.保证血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节.1．血清种类
目前用于组织培养的血清主要是牛血清,培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等.选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解.牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适.
牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能.牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清.胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛.显然,胎牛血清是品质最高的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少.2．血清的主要成分
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已知,但还有一部分尚不清楚,且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异.血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等,这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的.对血清的成分和作用的研究虽有很大进展,但仍存在一些问题.主要是：第一：血清的成份可能有几百种之多,目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识,这给研究工作带来许多困难.第二：血清都是批量生产,各批量之间差异很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保证每批血清的相似性极为困难,从而使实验的标准化和连续性受到限制.第三：不能排除血清中含有易变物质,这被认为是“瓶中恶化”的原因之一.3．血清主要作用
提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质.
提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等.生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等.
提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁.结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用.
提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤.
对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞,如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用.这种作用是偶然发现的,现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用.因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代.血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用.血清还含有一些微量元素和离子,他们在代谢解毒中起重要作用,如SeO3,
硒等.4．细胞培养中使用血清的缺点
血清成分复杂,虽含许多对细胞有利成分,也含有对细胞有害的成分,使血清有几个明显的缺点：
对大多数细胞,在体内状态,血清不是它们接触的生理学液体,只是在损伤愈合

㈨ 胶原酶和胰酶在细胞原代培养中的区别

胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，作用对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。消化原代培养的上皮类细胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂.胰蛋白酶是一种胰脏制品,对蛋白质有水介作用,主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开,在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同,对细胞的消化能力也不同,胰蛋白酶对细胞的作用,取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等.

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶,对胶原有很强的消化作用.适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织,它对细胞间质有较好的消化作用,对细胞本身影响不大,可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害.该酶分离效果好,即使有钙、镁离子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培养液配制,即操作简便又可提高细胞成活率,最终浓度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用缓和,无需机械振荡,但胶原酶价格较高,大量使用将增加实验成本.