A. 請敘述細胞化學法在細胞內脂類的顯示實驗中的應用
1. 金屬沉澱法：利用金屬化合物在反應過程中生成有色沉澱，藉以辨認所檢查的
物質或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物後，反應產物最終生成CoS 或PbS
有色沉澱，而顯示出酶活性。
2. 偶氮偶聯法：酚類化合物與偶氮染料結合後可以形成耐曬染料。
3. Schiff 反應：細胞中的醛基可使Schiff 試劑中的無色品紅變為紅色。這種反應通
常用於顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen 反應）。
4. 聯苯胺反應：過氧化氫酶分解H202。產生新生氧，後者再將無色的聯苯胺氧化
成聯苯胺藍，進而變成棕色化合物。
5. 普魯士藍反應：三價鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍。
6. Formazane 反應：顯示脫氫酶。
7. 「Nadi」反應：顯示細胞色素氧化酶。
8. 脂溶染色法：借蘇丹染料溶於脂類而使脂類顯色。
9. 茚三酮反應：顯示蛋白質。
B. 細胞通透性實驗中，10%氯化鈉、0.32M甘油、0.32M乙醇、0.32M丙醇試劑一般都是怎麼配製的
10%氯化鈉應該是在450mL蒸餾水中溶解50g NaCl，即配製成500g的10%氯化鈉溶液；
0.32M甘油：0.50L×0.32mol/L×92g/mol÷1.26g/mL = 11.7mL，量取11.7mL甘油轉移到500mL的容量瓶中，用蒸餾水加到刻度線，蓋上塞子，上、下倒置振盪幾次即成500mL溶液；
0.32M乙醇：0.50L×0.32mol/L×46g/mol÷0.79g/mL = 9.3 mL，量取9.3mL無水乙醇轉移到500mL的容量瓶中，用蒸餾水加到刻度線，蓋上塞子，上、下倒置振盪幾次即成500mL溶液；
0.32M丙醇：0.50L×0.32mol/L×60g/mol÷0.80g/mL = 12 mL，量取12mL丙醇轉移到500mL的容量瓶中,用蒸餾水加到刻度線，蓋上塞子，上、下倒置振盪幾次即成500mL溶液；
你如果不是配製500mL溶液，可按此比例計算用量，然後再進行配製。
C. 如何做好免疫細胞化學實驗
載玻片/蓋玻片處理
聚醚醯亞胺或多聚賴氨酸在室溫下包被蓋玻片1小時。
無菌水沖洗蓋玻片（3次 ，每次5分鍾）。
可將蓋玻片幹完全乾燥，並在紫外光下消毒至少4小時。
在玻片上種植細胞，或准備細胞離心塗片器，或做好塗抹准備。
磷酸鹽緩沖液（ PBS ）進行簡短的沖洗。
第一步：細胞固定
用預冷的甲醇、丙酮（ 1-10分鍾），或3-4 ％甲醛（PBS的pH值7.4）室溫（或者-20 ℃)固定細胞片15分鍾。
用預冷的PBS沖洗細胞片兩次。透化：如果目的蛋白是胞內表達，透化細胞非常重要。註：丙酮固定標本不需要透化。
用含0.25% Triton X-100或100 μM 洋地黃皂苷 or 0.5% 皂苷的PBS室溫孵育標本10分鍾。Triton X - 100是目前最流行的通透劑，可提高抗體的滲透程度。但這不適合與膜相連抗原的使用，因為它會將膜破壞。
PBS清洗細胞片3次，每次5分鍾。
第二步：封閉和孵育
PBST孵育細胞（1 ％牛血清白蛋白），室溫30分鍾，以封閉抗體非特異性結合位點（封閉液也可以是1 ％明膠或10 ％的血清，此血清需來自二抗產生的物種體內） 。
加入一抗在濕盒內孵育細胞片（在使用含1% BSA PBST稀釋抗體的），室溫1小時或4 ℃過夜。
緩慢倒出溶液，PBS清洗細胞片的3次，每次5分鍾。
加入含1 ％BSA的二抗稀釋液，室溫避光孵育1小時（避光）。
緩慢倒出二抗溶液，PBS清洗3次，每次5分鍾（避光）。
第三步：復染
在0.1-1 μg/ml Hoechst or DAPI (DNA染液)下孵育細胞1分鍾。
PBS清洗。
第四步：封片和觀察
滴加一滴封片劑封片劑質，蓋上蓋玻片。
用指甲油密封蓋玻片，以防止乾燥和顯微鏡觀察時移動。
觀察後的細胞片可避光保存在-20或4°C。
D. 檢測生物組織中的油脂的實驗是否觀察到位於兩個細胞之間的脂肪滴，如何解釋
位於兩個細胞之間的脂肪滴可能是在製作切片時細胞破碎,細胞中的脂肪滴改變了位置.
E. 在做觀察細胞中油脂的實驗時,加入酒精有何作用
首先，酒精能改變細胞膜的通透性，其次，酒精能讓細胞更好的與顏料結合，使細胞更好觀察
F. 只能用甲醇溶的葯物怎麼做細胞實驗
做細胞實驗，濃度都是nmol到μmol級別的，通常我們都用DMSO溶解成1000倍的母液，然後加在細胞培養液里。
G. 為什麼使用a549細胞做毒性實驗
為什麼使用a549細胞做毒性實驗
1、培養A549細胞，了解A549細胞的倍增周期，擴增A549細胞；2、收集A549細胞並計數，按照一定的密度如2500細胞/孔，25uL/孔(參考值，需進行優化)進行鋪板；3、在細胞板內培養一定時間，如24h等，該時間需要根據具體實驗和鋪板密度來確定，並且需要優化，至少要等到細胞貼壁之後才可以進行下一步；4、配製ABCD化合物溶液，通常將化合物溶解在DMSO中。由於細胞對DMSO敏感，因此在進行正式實驗之前需要對實驗體系進行DMSO耐受測試，獲得A549在該實驗體系中的最大DMSO耐受量。假設A549能夠耐受1%的DMSO，那麼需要配製100×終濃度的ABCD化合物溶液，並用培養基稀釋到終濃度。5、棄掉細胞培養板中的培養液，將配好的化合物溶液轉移到細胞培養板中，進行加葯處理；6、培養一段時間，例如24h，48h等(該時間需要進行優化)，取出細胞培養板，向其中加入PromegaCaspase3/7Glo檢測試劑，震盪10分鍾後用酶標儀讀板。7、將獲得的數值與陰性對照、陽性對照進行比較並轉換成作用百分比，即可判斷該化合物是否有效。如果化合物配製時是配製的梯度溶液，還能獲得活性化合物的IC50.
H. 檢測生物體內糖類,脂肪,蛋白質 所有實驗步驟和注意事項,
一．實驗目的：嘗試用化學試劑檢測生物組織中糖類、脂肪和蛋白質
二．實驗原理：某些化學試劑能使生物組織中的有關有機化合物,產生特定的顏色反應.
1．可溶性還原糖（如葡萄糖、果糖、麥芽糖）與斐林試劑發生作用,可生成磚紅色的Cu 2O沉澱.即Cu ( OH ) 2被還原成Cu 2O,葡萄糖被氧化成葡萄糖酸.
2．脂肪可以被蘇丹Ⅲ染液染成橘黃色（或被蘇丹Ⅳ染液染成紅色）.
3．蛋白質與雙縮脲試劑發生作用,產生紫色反應.（蛋白質分子中含有很多肽鍵,在鹼性NaOH溶液中能與雙縮脲試劑中的Cu2+作用,產生紫色反應.）
4.澱粉遇碘變藍色.
三．實驗材料
1．做可溶性還原性糖鑒定實驗,應選含糖高,顏色為白色的植物組織,如蘋果、梨.（因為組織的顏色較淺,易於觀察.）
2．做脂肪的鑒定實驗.應選富含脂肪的種子,以花生種子為最好,實驗前一般要浸泡3-4小時（也可用蓖麻種子）.
3．做蛋白質的鑒定實驗,可用富含蛋白質的黃豆或雞蛋清.
四、實驗試劑
斐林試劑（包括甲液：質量濃度為0.1g/ mL NaOH溶液和乙液：質量濃度為0.05g/ mL CuSO4溶液）、蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ染液、雙縮脲試劑（包括A液：質量濃度為0.1g/ mL NaOH溶液和B液：質量濃度為0.01g/ mL CuSO4溶液）、體積分數為50%的酒精溶液,碘液、蒸餾水.
五、方法步驟：
（一） 可溶性糖的鑒定
操 作 方 法
注 意 問 題
解 釋
1.制備組織樣液.
（≠組織液、≠細胞液）
蘋果或梨組織液必須臨時制備
因蘋果多酚氧化酶含量高,組織液很易被氧化成褐色,
將產生的顏色掩蓋.
2.注入2mL組織樣液.
3.注入1mL新制的斐林試劑,振盪.
（現配現用、先混後加）
應將組成斐林試劑的甲液、乙液分別配製、儲存,使用前才將甲、
乙液等量混勻成斐林試劑；切勿將甲液、乙液分別加入蘋果組織樣液中進行檢測.
斐林試劑很不穩定,甲、乙液混合保存時,生成的Cu ( OH ) 2在70-900C下分解成黑色CuO和水；甲、乙液分別加入時可能會與組織樣液發生反應,無
Cu ( OH ) 2生成.
4.水浴加熱：試管放在盛有50-650C溫水的大燒杯中,加熱約2分鍾,觀察到溶液顏色：淺藍色 → 棕色 → 磚紅色（沉澱）
最好用試管夾夾住試管上部,使試管底部不觸及燒杯底部,試管口不朝向實驗者.
也可用酒精燈對試管直接加熱.
防止試管內的溶液沖出試管,造成燙傷；
縮短實驗時間.
（二）脂肪的鑒定
操 作 方 法
注 意 問 題
解 釋
取材、切片、製片：花生種子浸泡、去皮、切下一些子葉薄片,將薄片放在載玻片的水滴中,用吸水紙吸去裝片中的水.
干種子要浸泡3-4小時,新花生的浸泡時間可縮短.
浸泡時間短,不易切片,浸泡時間過長,組織較軟,切下的薄片不易成形.切片要盡可能薄些,便於觀察.
染色：在子葉薄片上滴2-3滴蘇丹Ⅲ（染色3分鍾）或蘇丹Ⅳ染液（染色1分鍾）.
染色時間不宜過長.
漂洗：用吸水紙吸去薄片周圍染液,用50%酒精洗去浮色,吸去酒精.
酒精用於洗去浮色,不洗去浮色,會影響對橘黃色脂肪滴的觀察.同時,酒精是脂溶性溶劑,可將花生細胞中的脂肪顆粒溶解成油滴.
用吸水紙吸去薄片周圍酒精,滴上1-2滴蒸餾水,蓋上蓋玻片.
滴上清水可防止蓋蓋玻片時產生氣泡.
鏡檢：先低後高（高倍鏡用法：移物換器時針反）,低倍鏡下找到花生子葉薄片的最薄處,可看到細胞中有染成橘黃色或紅色圓形小顆粒.
裝片不宜久放.
時間一長,油滴會溶解在乙醇中.
三、蛋白質的鑒定
操 作 方 法
注 意 問 題
解 釋
制備組織樣液.
（浸泡、去皮研磨、過濾.）
黃豆浸泡1至2天,容易研磨成漿,
也可購新鮮豆漿以節約實驗時間.
加樣液約2ml於試管中,
加入雙縮脲試劑A,搖勻；再加入雙縮脲試劑B液3-4滴,搖勻,溶液變紫色.
A液和B液也要分開配製,儲存.鑒定時先加A液後加B液.
CuSO4溶液不能多加.
先加NaOH溶液,為Cu2+與蛋白質反應提
供一個鹼性的環境.A、B液混裝或同時加入,會導致Cu2+變成Cu ( OH ) 2沉澱,而失效.
否則CuSO4藍色會遮蓋反應的真實顏色.
可用蛋清代替豆漿.
蛋清要先稀釋.
如果稀釋不夠,在實驗中蛋清粘在試管壁,與雙縮脲試劑反應後會粘固在試管內
壁上,使反應不容易徹底,並且試管也不易洗干凈.
附：澱粉的檢測和觀察用試管取2ml待測組織樣液,向試管內滴加2滴碘液,觀察顏色變化.
碘液不要滴太多
以免影響顏色觀察
I. 有哪位高手能詳細指導一下用transwell板做細胞趨化實驗的具體方法和步驟嗎
1 材料與方法
1. 1
Matrigel：Becton Dickinson Compary, - 20 ℃保存；
Tanswell plate：Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直徑為8μm；
蘇木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。
1. 2 趨化因子的制備 取傳代第二天長勢良好的NIH3T3細胞,無血清培養基輕柔漂洗兩次; 加入無血清培養基,37℃,5 %CO2 培養24 h～48h，收集細胞培養上清；4 ℃,12 000rpm 離心,10 min ,取上清；0.22 μm 濾膜過濾除菌；分裝,在- 20 ℃保存。
1. 3
transwell 培養板准備 所有操作均需無菌操作。-20℃保存的Matrigel 在冰上保2℃～8℃過夜融化。在冰上用預冷的槍頭吸取100μl Matrigel 加入冰預冷的300μl 無血清培養基中,充分混均。取上述稀釋的Matrigel 25 μl 加入transwell 板上室,覆蓋整個聚碳酯膜,37 ℃,30 min ,使Matrigel 聚合成膠。已鋪好Matrigel的transwell 培養板置於37℃可保存2 周。
1. 4
Matrigel 侵襲實驗(Matrigel Invasion Assay)刺激後的各組細胞用PBS 漂洗3 次。以常規方法用無血清培養基制備單細胞懸液,5 ×105個細胞/ ml ,每組細胞各分為兩部分。胎盤蘭拒染實驗,細胞活力需大於95 %。Transwell 培養板上室加入100μl 細胞懸液( 5 ×104 個) 並加入無血清培養基200 ul 。Transwell 培養板下室加入500μl 趨化因子,37℃,5 %CO2 培養24 h。用濕棉簽輕輕擦去Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞。小心取出上室,用線拴住,並做好標記,用冰預冷的甲醇固定30 min。蘇木素染色1 min。梯度乙醇脫水(80 % ,95 % ,100 %) ,二甲苯透明。小心將聚碳酯膜自上室基底切取下來,置載玻片上中性樹脂封片。附著於聚碳酯膜下表面的細胞在高倍鏡下( ×400) 隨機取6 個視野[1 ] 計數,取平均數。重復實驗兩次。
注意 2. 1
NIH3T3 細胞制備的趨化因子與胎牛血清 趨化因子是能使細胞產生趨化運動的一類細胞因子[2 ] 。目前利用NIH3T3 細胞制備趨化因子做細胞體外侵襲實驗的實驗室比較多,時間較長且實驗步驟繁瑣。眾所周知,胎牛血清中有趨化因子,我們在不同濃度TNFα刺激下的HCCC29810 膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱實驗中發現用胎牛血清和用NIH3T3 細胞制備的趨化因子做細胞體外侵襲實驗效果是一樣的,兩組遷移的細胞數很接近。在實驗時間上，用NIH3 T3細胞制備趨化因子做細胞體外侵襲實驗周期為1 周,而用胎牛血清作趨化因子做細胞體外侵襲實驗周期為2 d ,實驗時間節省了很多。因此認為可以用胎牛血清來代替NIH3T3 細胞制備的趨化因子。
2. 2 細胞的准備 所需細胞應處在對數生長期,細胞活力需大於95 %。如果細胞活力小,就會造成細胞穿透能力下降,影響實驗結果。
2. 3 擦去Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞 先用干棉簽將上室內液體吸去,再用蒸餾水浸濕的棉簽輕輕擦去Mat rigel 凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞,如果沒有擦凈聚碳酯膜上表面的細胞,在細胞計數時就會將沒擦掉的細胞也計進來。尤其是細胞為圓形的時候,就會分辨不出是穿過去的細胞還是沒穿過去的細胞,對於長梭形細胞來說,穿過去的細胞為長梭形,沒穿過去的細胞多為圓形。
2. 4 蘇木素染色 上室浸泡在新蘇木素中的時間為1 min ,用過多次的蘇木素為2 min。在研究粉防己鹼對HUVEC 人類臍靜脈內皮細胞遷移能力的抑製作用沒有將多餘蘇木素洗去,直接脫水、透明,造成細胞圖片背景模糊,細胞不清楚(見圖1) 。在作不同濃度TNFα刺激下的HCCC29810 膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱實驗時我們將其置於盛有自來水的燒杯中,反復漂洗幾次,將多餘蘇木素洗去再行脫水、透明;這樣做出的細胞圖片背景干凈,細胞清楚(見圖2) 。
J. 總結細胞內化合物的鑒定原理和現象
蛋白質 蛋白質+雙縮脲試劑→紫色結合物 溶液變紫
脂類 脂質小顆粒+蘇丹Ⅲ染液→橘黃色小顆粒 溶液變黃
糖類 可溶性還原糖+斐林試劑→磚紅色沉澱 生成磚紅色沉澱
核酸 核酸分子因含磷酸根呈酸性,它們對鹼性染料甲基綠和派洛寧具有親和力
DNA+甲基綠→綠色
RNA+派洛寧→紅色