03的膠原酶怎麼配置

⑴ sigma的膠原酶可以用PBS配製嗎

sigma的膠原酶不可以用PBS配製
需要用HBSS緩沖液（即hanks液）配製，沒有的話用DMEM也行
上述兩種都含有鈣離子，而膠原酶的活性是有賴於鈣離子的
所以sigma的膠原酶不可以用PBS配製

⑵ 請教內皮細胞培養遇到的問題

請教內皮細胞培養遇到的問題
血管內皮細胞培養基
上皮細胞培養1)表皮細胞培養1.取材：取外科植皮或手術殘余皮膚小塊,以角化層薄者為佳,早產流產兒皮膚更好,切成0.5～1 平方厘米小塊.2.EDTA 處理：先置入0.02%EDTA 中室溫置5 分鍾.3.冷消化：換入0.25%胰蛋白酶中,置4℃過夜.4.分離：取出皮膚,用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開.5.溫消化：取出表皮單獨處理,用剪刀剪成更小的塊後,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化30～60 分鍾.6.用吸管輕輕反復吹打,使成細胞懸液.7.培養液：通過80 目不銹鋼紗網濾過後,低速離心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清,製成細胞懸液,接種入碟皿中,CO2 溫箱培養.2) 乳腺組織培養直接培養法：(適於培養含纖維少的軟組織)1.在含有少量培養液或Hanks 液的容器中,用鋒利刀片將組織反復切割成碎塊.2.把組織碎塊連同液體注入離心管中,再補加少許培養液,用吸管吹打片刻,置試管架3～5 分鍾.吸除上層液可排除非乳腺細胞部分.重復2～3 次.3.末次處理結束後,向沉降管中再補加培養液,用吸管稍吹打,使沉降物重懸.不待細胞團塊下降立即通過3～4 層無菌紗布濾入另管中.4.調整好適宜密度,接種入培養瓶中培養.膠原酶消化法：(適於處理含纖維多的較硬組織)其過程與培養其它組織相同.3) 胃上皮細胞培養1.取材：取胃潰瘍或胃癌手術切除胃標本遠端非病變區粘膜少許.2.清洗：用含慶大黴素(400 微克/毫升)和二性黴素(2 微克/毫升的Hanks)液漂洗後,用鈍器剝離下粘膜,剪成1mm3 大小.3.消化：在I 型膠原酶和透明質酸酶中,於37℃中消化80 分鍾.4.離心：收集細胞懸液,800 轉/分離心後,Hanks 液漂洗兩次.5.接種：末次離心後加入含有1%～2%胎牛血清的完全培養基,接種入不同孔數的培養板中,接種量依不同實驗目的而定.4) 肝細胞培養初代組織塊培養：取新鮮肝臟,先剝除被膜和血管等纖維成分,用刀或剪刀把肝臟剪成1mm3 左右的小塊,採用帖壁培養法.初代消化法培養：1.把肝組織切成2～4 立方毫米的小塊,用不含鈣鎂的BSS 液洗兩次.2.移入1：1 的0.1%胰蛋白酶和0.1%膠原酶(都用無鈣鎂BSS 配置)中,4℃冷消化10～12 小時後,通過250 微米和64 微米尼龍網或不銹鋼紗網濾過.3.收集細胞、BSS 液洗1～2 次、計數、接種培養.消化培養肝細胞的另一種方法是灌流法(肝臟灌流需用全肝,以較小動物如小鼠和大鼠為好)：1.無菌解剖動物,取出肝臟,先用BSS 洗除血污.2.取5ml 注射器一支,吸取消化液後,把注射器頭輕輕插入肝管中,用線繩結扎牢固,以防消化液漏出,輕輕把消化液注入肝管系統,並不時輕揉壓肝臟,以便消化液進入肝小葉中;消化液在肝內停留20～30 分後,在吸出消化液的同時並輕揉壓肝臟,以使肝細胞脫落和消化液吸出.3.待吸凈消化液後,注入離心管中,低速離心分離,用RPMI 1640 培養基培養(較其它培養基為好),能獲得較純的肝上皮細胞和獲較好的效果.傳代培養：待細胞生長連接成片後,用BSS 洗一二次,加1：1 的0.025%胰蛋白酶和0.02% EDTA 混合消化3～5 分鍾,待細胞回縮,便停止消化,棄掉消化液,用BSS洗一二次,注入營養液,吹打,製成細胞懸液,再接種培養.5)內皮細胞培養1.取產後的新鮮臍帶.如不立即培養可以保存於4℃中,但不宜超過12 小時.無菌剪取長10～15 厘米一段.其它如胚胎和幼體動物的大血管,亦可用於培養.2.先用三通注射器吸溫PBS 液注入臍帶的靜脈中,洗除殘血,注入口處宜用線繩結扎,以防液體返流.3.用血管鉗夾緊臍帶一端,從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為0.1%的膠原酶,待末端出現液體後結扎之,令充滿血管,注入口亦應結扎,以防液體返流,消化3～10 分鍾.4.吸出含有內皮細胞的消化液,注入離心管中,為獲取更多細胞,可再注入溫PBS 沖洗2～3 次徹底清除干凈殘余細胞,一並注入離心管中離心.5.吸除上清,加1640 培養液,製成細胞懸液,接種入瓶皿中培養,順利時2～3 天內細胞即可長成單層.6)毛細血管內皮細胞培養腫瘤條件培養基制備：1.取C3H 小鼠的S-180 實體肉瘤組織.2.胰蛋白酶消化,Dulbecco 改良Eagle 氏培養液15ml(含10%小牛血清),接種到T-75 Falcon 產培養瓶中培養.3.在細胞生長接近完全匯合時,收集培養液製成條件培養基;再用含10%小牛血清的新培養液後,也每隔兩天收集一次,可獲得多量條件培養基.4.4000 轉/分離心後,再通過0.22μm 微孔濾膜濾過,-20℃凍存備用(臨用前融解).初代培養：1.取材：取新鮮牛腎上腺數個,先用Hanks 液洗除血污.2.剝除被膜,分離出皮質,切成1 立方毫米小塊,加0.5%膠原酶室溫中消化1 小時,每隔10 分鍾用吸管吹打懸液令消化充分.3.通過不銹鋼紗網濾過,網眼要求只允許能通過小於110 微米長的毛細血管小段.4.650rpm,4℃,離心7 分鍾後,棄掉上清膠原酶.5.沉澱物用培養液重懸並離心,再重懸,再離心,共兩次.6.末次沉澱物仍用含有10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle 氏培養液重懸後,稍吹打.7.接種於鋪有明膠底層的培養皿中,37℃培養,在培養頭1～3 小時中,毛細血管小段和內皮細胞最先帖附於底物上,而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養液中漂浮.8.趁此時,吸除培養液,再加入腫瘤條件培養液,每兩天換液一次.毛細血管小段一般成自1～4 個內皮細胞,以後每個小段在底物上慢慢展成特殊形態的細胞島,能持續2～5 天.毛細血管內皮細胞分離培養：1.初代培養2～3 天後,鏡下確認幾個毛細血管內皮細胞島,在培養皿背面,用不脫色筆劃圈圈起.2.鏡下檢查,如圈內殘有非內皮細胞時,可用顯微細針在倒置顯微鏡下挑除.此操作用細胞解剖器或用手操作均可,宜在凈化台無菌氣流中、打開培養皿蓋進行,但時間不宜過長(15～20 分鍾),圈內非內皮細胞可用無菌膠刮除.3.用培養液漂洗兩次,以去除漂浮細胞.4.剩餘內皮細胞島如小(5～20 個細胞)而少時,生長增值變得緩慢或不完全不生長,此時需加入3T3 等飼細胞,飼細胞接種量為4000 細胞/cm2.5.當內皮細胞充滿所有飼細胞空間後,用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養基.6.接種入明膠底物皿中繼續培養(飼細胞死亡淘汰),細胞增殖生長匯合後,按1：5 傳代.

⑶ 膠原酶的配置

膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。
注意：
因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。
鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。

⑷ 如何配置膠原酶2u/ml的膠原酶溶液，需要多少毫克膠原酶

梯度的配置一般高往低逐步稀釋，一般現配一個大濃度的儲備液你可以配1g/ml的，方法是稱取100g的樣品溶解後用100ml的容量瓶定容
50mg/ml的配置：量取5ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
40mg/ml：量取4ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
30mg/ml：量取3ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
,20mg/ml：量取2ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
10mg/ml：量取1ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
望採納，謝謝

⑸ 0.1%的四型膠原酶和0.1%的鏈霉蛋白酶如何配製

蛋白酶是水解蛋白質肽鏈的一類酶的總稱。按其降解多肽的方式分成內肽酶和端肽酶兩類。前者可把大分子量的多肽鏈從中間切斷，形成分子量較小的朊和腖；後者又可分為羧肽酶和氨肽酶，它們分別從多肽的游離羧基末端或游離氨基末端逐一將肽鏈水解生成氨基酸。

⑹ 誰知道0.2%Ⅱ型膠原酶和10%胎牛血清的怎麼配製

每 100mg 膠原酶加入 50ml 培養液中 攪拌
均勻 用 0.2 微米 微孔濾膜過濾分裝 -20 低溫冰箱保存

450mlDMEM+50mlFBS

⑺ 肝細胞培養

⑻ 膠原酶和胰酶在細胞原代培養中的區別

膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用，作用對象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。消化原代培養的上皮類細胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應用的消化劑.胰蛋白酶是一種胰臟製品,對蛋白質有水介作用,主要作用於賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開,在常用的蛋白酶中由於產品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的作用,取決於細胞類型、酶的活力、配製的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等.

膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶,對膠原有很強的消化作用.適於消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細胞間質有較好的消化作用,對細胞本身影響不大,可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害.該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養液配製,即操作簡便又可提高細胞成活率,最終濃度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無需機械振盪,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本.

⑼ 求助血管內皮細胞培養基

近期培養人主動脈內皮細胞，同學推薦用的是sciencell的內皮細胞培養基ECM，效果不錯，之前也是考慮這個培養基是低血清的可能效果不好，但是因為這個培養基里有配套的內皮細胞生長添加物，所以效果還是比普通的培養基要好很多，另外我是在北京從裕恆豐拿的，他們直接送貨上門，服務還是很給力的哈