① 膠原蛋白的生物學性狀
膠原作為醫用生物材料,最重要的特點在於其低免疫原性,與其它具有免疫原性的蛋白質相比,膠原蛋白的免疫原性非常低。人們甚至曾認為膠原不具有抗原性,研究表明:膠原具有低免疫原性,不含端肽時免疫原性尤其低。膠原有三種類型的抗原分子,第一類是膠原肽鏈非螺旋的端肽,在天然和變性膠原中均存在。由於2個不同種類的哺乳動物中間的膠原蛋白,其整個氨基酸序列變化不是很大,而且膠原蛋白的三螺旋區域有高度的進化穩定性,但在非螺旋的末端區域中有很大的變化性,在這區域中幾乎50%以上的氨基酸殘基表現出種屬性變化,大量的研究和生產都集中在如何完全去除端肽,只要去除端肽就認為是安全的。第二類是膠原的三股螺旋的構象,僅存在於天然膠原分子中,即位於天然膠原蛋白的三螺旋結構中的抗原決定簇,會在分離和純化過程中暴露出來,尤其是含α1和α2單鏈暴露出的中央端情況下更為明顯。第三類是α-鏈螺旋區的氨基酸順序,只出現在變性膠原中。
免疫學分析和研究結果表明,使用膠原加完全弗氏佐劑,能對膠原產生多克隆和單克隆抗體。由T細胞啟動的對膠原蛋白免疫反應的證據是,位於重要組織相容性(H-2)部位上ⅠA或ⅠB亞區的免疫反應基因已被鑒定。膠原蛋白免疫原性的臨床評價通常是皮膚過敏性測試(細胞免疫指數,遲發性Ⅳ型反應)和由反應型抗體的存在(體液免疫指數)來確定的。實踐證明,在患者身上進行這兩種評價是合理的。在治療前,用過敏劑量的植入性膠原對患者進行皮試,大約3%有潛在的反應,反復多次處理的患者,大約1%~2%會產生遲發性過敏性的臨床病狀,典型的症狀包括局部水腫和紅斑反應,有的還伴有硬化和瘙癢,持續時間4~6個月,個別甚至可達1年以上。 膠原蛋白是肌體自然蛋白,對皮膚表面的蛋白質分子具有較大的親和力、較弱的抗原性、良好的生物相容性和生物降解安全性,可降解吸收,粘著力好。由膠原製成的手術縫合線既有與天然絲一樣的高強度,又有可吸收性,在使用時既有優良的血小板凝聚性能,止血效果好,又有較好的平滑性和彈性,縫合結頭不易鬆散,操作過程中不易損傷機體組織,對創面有很好的黏附性,一般情況下只需較短時間的壓迫就可達到滿意的止血效果。所以膠原蛋白可以製成粉狀、扁狀及海綿狀的止血劑。同時用合成材料或膠原蛋白在血漿代用品、人造皮膚、人工血管、骨的修復和人工骨和固定化酶的載體等方面的研究和應用方面都十分的廣泛。
膠原蛋白分子肽鏈上具有多種反應基團,如羥基、羧基和氨基等,易於吸收和結合多種酶和細胞,實現固定化,它具有與酶和細胞親合性好、適應性強的特點。另外,膠原易加工成型,故純化的膠原蛋白可製成許多不同形式的材料,如膜,帶,薄片,海綿,珠體等,但以膜形式應用的報道最多。膠原制備膜用於生物醫學,除具有生物可降解性、組織可吸收性、生物相容性、弱抗原性外,還主要有:親水性強,抗張強度高,具有類似真皮的形態結構,透水透氣性好;高抗張強度和低延展性決定的生物塑性;官能團多,可進行適度交聯改性,從而可控制其生物降解速度;可調節溶解(溶脹)性;與其它生物活性組分一起使用,具有協同效應;可與葯物相互作用;交聯或酶處理去端肽可使抗原性降低,可隔離微生物,有生理活性,如有血凝作用等優點。同時也存在以下缺點:膠原的分離純化及加工處理復雜,分離的膠原交聯密度、纖維大小等具有多樣性。酶解膠原速度多變,條件難於控制;且純膠原乾燥後質地脆,成膜能力並不強,其膜延展性低,易乾裂,抗水性差,遇水易溶脹,在體內易降解,潮濕環境中易受細菌侵蝕而變質,此外還可能導致一些副反應,如組織鈣化等。故實際應用中,常常通過一定方法將膠原蛋白改性,通過改性避免膠原蛋白制備材料的缺點,提高膠原的拉伸強度及抗降解能力,降低膨脹率,改善膠原的力學性能與抗水性。
臨床應用形式有水溶液、凝膠、顆粒劑、海綿和薄膜等。同樣這些形狀都可用於葯物緩釋,已獲准上市和正在研發的膠原蛋白葯物緩釋應用大都集中在眼科中抗感染和青光眼治療,創傷中的局部治療及傷口修復的控制感染,婦科的宮頸發育異常和外科的局部麻醉等。 由於膠原蛋白廣布於人體各組織中,系各組織中的重要成分並構成組織細胞外基質(Extracelluarmatrix,ECM),其性質是一種天然的組織支架材料。從臨床應用的角度,人們用膠原蛋白製成各種各樣的組織工程支架,如皮膚、骨組織、氣管和血管支架等。然而以膠原本身而言就有兩大類,即純膠原制備的支架和與其它成分復合而成的復合物支架。純膠原蛋白組織工程支架具有生物相容性好、易加工、可塑性並能促進細胞黏附、增殖等優點,但也有膠原蛋白的力學性能差,在含水時難以塑形,無法支撐組織重建等不足。其次在修復處的新生組織會產生各種各樣的酶,將膠原蛋白水解,導致支架崩解,而採用交聯或復合的方式能改善與提高。現已成功地將膠原蛋白基生物材料用於人工皮膚、人工骨、軟骨移植和神經導管等組織工程產品。有人用嵌入軟骨細胞的膠原蛋白凝膠來修復軟骨缺陷並嘗試用上皮、內皮和角膜細胞附在膠原蛋白海綿以適應角膜組織。還有人混合自體同源的間葉細胞中的莖狀細胞和膠原蛋白凝膠製作肌腱用於腱後修復。
以膠原蛋白為基質作真皮輔以上皮成分構成的組織工程人工皮膚葯物緩釋膠以膠原蛋白為主要成分的給葯系統應用非常廣泛,可以把膠原蛋白水溶液塑造成各種形式的給葯系統,如眼科方面的膠原蛋白保護物、燒傷或創傷使用的膠原海綿、蛋白質傳輸的微粒、膠原蛋白的凝膠形式、透過皮膚給葯的調控材料以及基因傳輸的納米微粒等。此外,還可作為組織工程包括細胞培養系統的基質、人工血管和瓣膜的支架材料等。 膠原蛋白由動物皮提取,皮中除膠原蛋白外還含有透明質酸、硫酸軟骨素等蛋白多糖,它們含有大量極性基團,是保濕因子,且有阻止皮膚中的酪氨酸轉化為黑色素的作用,故膠原蛋白有純天然保濕、美白、防皺、祛斑等作用,可廣泛應用於美容用品中。膠原蛋白的化學組成、結構賦予了它是美容的基礎。膠原蛋白與人體皮膚膠原的結構相似,為非水溶性纖維狀含糖蛋白質,分子中富含大量氨基酸和親水基,具有一定的表面活性和很好的相容性,同時由於其分子中含有大量的羥基,因此它有著相當好的保濕作用。在相對濕度70%時,仍可保持其自身重量45%的水分。試驗證明:0.01%的膠原蛋白純溶液就能形成很好的保水層,供給皮膚所需要的全部水分。
隨著年齡的增長,成纖維細胞的合成能力下降,若皮膚中缺乏膠原蛋白,膠原纖維就會發生聯固化,使細胞間粘多糖減少,皮膚便會失去柔軟、彈性和光澤,發生老化,同時真皮的纖維斷裂、脂肪萎縮、汗腺及皮脂腺分泌減少,使皮膚出現色斑、皺紋等一系列老化現象。將其作為活性物質用於化妝品中時,後者可以擴散到皮膚的深層,其含有的酪氨酸與皮膚中的酪氨酸競爭,而與酪氨酸酶的催化中心結合,從而抑制黑色素的產生,使皮膚中的膠原蛋白活性增強,保持角質層水分以及纖維結構的完整性,促進皮膚組織的新陳代謝,對皮膚產生良好的滋潤保濕、消皺美容作用。早在20世紀70年代初,美國就率先推出注射用牛膠原,用於祛斑除皺紋及修復瘢痕。
不過在化妝品中,單純用作營養性護膚類原料通常要求分子量在2KD以下,以讓水解膠原能滲透入皮膚內。而護發類化妝品除要求水解膠原具有保濕性以外,還應具有一定的成膜性,因此,水解膠原的分子量要求會更高。 膠原蛋白亦可用於食品,早在十二世紀Bingen 的 St.Hilde-gard 就描述了利用小牛的軟骨湯作為葯物來治療關節疼痛,在相當長的一段時間里,含膠原的一些產品被人們認為對關節是很有益處的。因為它具有適用於食品的一些屬性:食用級通常外觀為白色,口感柔和,味道清淡,易消化。可以降低血甘油三酯和膽固醇,並可以增高體內某些缺乏的必需微量元素使之維持在一個相對的正常范圍之內,它是一種理想的降血脂食品。此外,有研究表明,膠原蛋白可以協助排除體內的鋁,減少鋁在體內的聚集,降低鋁質對人體的危害,並一定程度上促進指甲和頭發的生長。Ⅱ型膠原是關節軟骨中的主要蛋白,因而是潛在的自身抗原。口服後能誘導T細胞產生免疫耐受,從而抑制T細胞介導的自身免疫性疾病。膠原多肽是膠原或明膠經蛋白酶等降解處理後製得的具有較高消化吸收性、分子量約為2000~30000的產物,不具有明膠的凝膠性能,市場上銷售的膠原多為膠原多肽。
膠原的一些品質使得它在許多食品中用作功能物質和營養成分具有其它替代材料難以比擬的優點:膠原大分子的螺旋結構和存在結晶區使其具有一定的熱穩定性;膠原天然的緊密的纖維結構使膠原材料顯示出很強的韌性和強度,適用於薄膜材料的制備;由於膠原分子鏈上含有大量的親水基團,所以與水結合的能力很強,這一性質使膠原在食品中可以用作填充劑和凝膠;膠原在酸性和鹼性介質中膨脹,這一性質也應用於制備膠原基材料的處理工藝中。
膠原蛋白粉可直接加入到肉製品,以影響肉類的嫩度和肉類蒸煮後肌肉的紋理。研究表明,膠原蛋白對原料肉和烹飪肉質地的形成非常重要,膠原蛋白含量越高,肉的質地越硬。像魚肉的嫩化被認為與V型膠原蛋白降解有關,其肽鍵的破壞引起的細胞外周膠原纖維的裂解被認為是肌肉嫩化現象的主要原因。通過破壞膠原蛋白分子內的氫鍵,使原有的緊密超螺旋結構破壞,形成分子較小、結構較為鬆散的明膠,既可改善肉質的嫩度又可提高其使用價值,使其具有良好的品質,增加蛋白質含量,既口感好又有營養。日本還開發出了動物膠原蛋白為原料經膠原蛋白水解酶水解、調制開發出新型調味品和清酒,不但有特殊的風味,還能補充部分氨基酸。
隨著各類香腸製品在肉製品中所佔的比例越來越大,天然的腸衣製品嚴重缺乏。研究人員正致力於替代品的開發,以膠原蛋白質為主要的膠原腸衣本身是營養豐富的高蛋白物質,在熱處理過程中隨著水分和油脂的蒸發與溶化,膠原幾乎與肉食品的收縮率一致,而其他的可食用包裝材料還沒有被發現具有這種品質。另外,膠原蛋白本身具有固定化酶的功能,具有抗氧化性,可以改善食品的風味和質量。產品應力與膠原蛋白含量的多少成正比,而應變則成反比。 膠原蛋白是人體骨骼,尤其是軟骨組織中的重要組成成分。膠原蛋白就像骨骼中的一張充滿小洞的網,它會牢牢地留住就要流失的鈣質。沒有這張充滿小洞的網,即便是補充了過量的鈣,也會白白地流失掉。而膠原蛋白的特徵氨基酸羥基脯氨酸是血漿中運輸鈣到骨細胞的工具。骨細胞中的骨膠原是羥基磷灰石的黏合劑,它與羥基磷灰石共同構成了骨骼的主體。而骨質疏鬆的實質是合成骨膠原的速度跟不上需要,換言之,新的骨膠原的生成速度低於老的骨膠原發生變異或老化速度。研究表明,如果缺少膠原蛋白,補充再多的鈣質也無法防止骨質疏鬆,因此,只有攝入足夠的可與鈣結合的膠原蛋白,才能使鈣在體內被較快消化吸收,且能較快的達到骨骼部位而沉積。
將膠原蛋白和聚乙烯吡咯烷酮溶在檸檬酸緩沖液里製得膠原蛋白-PVP聚合物(C-PVP),用於受傷骨骼的加固不僅效果好,安全性也高,即使長周期的連續用葯,不管是實驗還是臨床試驗都不表現出淋巴腫大、DNA損傷,不會引起肝和腎的代謝紊亂,也不誘發人體產生抗C- PVP的抗體。 飼料用膠原蛋白粉是以製革的殘次皮料、皮邊角余料等副產物為原料,運用物理、化學或生物技術方法處理得到的蛋白質產品。製革廠鞣革後勻削和剪裁產生的固體廢棄物統稱為鞣革廢渣,其干物質的主要成分就是膠原蛋白。處理後可作為一種動物源性蛋白營養添加劑,替代或部分替代進口魚粉,用於混、配合飼料的生產,具有較好的飼喂效果和經濟效益。其蛋白質含量高,富含18種以上氨基酸,含有鈣、磷、鐵、錳、硒等礦物質元素,並帶有芳香味。研究表明,水解膠原蛋白粉可部分或全部替代生長肥育豬日糧中的魚粉或豆粕,但添加比例不能超過 6%,當含量達 8%時則顯著降低生產性能及日糧消化率,增加飼養成本。
還有人進行了生長試驗和消化試驗以評價水產飼料中膠原蛋白替代魚粉的效果。生長試驗是在基礎飼料(對照組,含魚粉 12%)中分別以 2%、4%膠原蛋白等重量替代魚粉飼養平均體重6.5g的異育銀鯽(共 315 尾)35 d,各組魚體增重率分別為 71.3%、70.9%、71.9%,各組間沒有顯著差異(P>0.05);消化試驗是採用平均體重 110g 的異育銀鯽,按套演算法測定了異育銀鯽對膠原蛋白的蛋白質消化率為 97.3%。研究結果表明,膠原蛋白具有很高的消化吸收率,可部分替代魚粉而對異育銀鯽的增重無影響。 有人研究了膳食銅缺乏與老鼠心臟膠原蛋白含量之間的關系。通過SDS- PAGE分析,再用考馬斯亮藍染色,結果表明檢測改變了的膠原蛋白的額外代謝特徵可預測銅缺乏;由於肝臟纖維化可減少蛋白質含量,因此還可通過測定肝臟中膠原蛋白的含量來預測肝臟纖維化。Anoectochilusformosanus的水提取物(AFE)則可降低CCl4誘發的肝臟纖維化,降低肝臟膠原蛋白的含量。膠原蛋白還是鞏膜的主要成分,對眼睛的作用也非常重要,如果鞏膜中膠原蛋白的合成減少而降解增加就會導致近視。
② 膠原是什麼物質!
膠原是蛋白質的一種。人體中有10萬種蛋白質,其中,膠原的量最多,它占人體蛋白質總量的30%左右。膠原是填補在細胞與細胞之間的成分(
細胞外基質
)的主要構成物。膠原的分子是像絲一樣的構造,許多膠原蛋白分子集合在一起就形成
膠原纖維
,這些纖維支撐著人體的各種組織。此外,膠原還具有幫助
細胞增殖
的功能。
人體內的膠原大約有40%存在於皮膚內。骨骼和軟骨中也含有許多膠原,它們約佔全部膠原的20%。其餘的膠原則存在於血管、肌腱以及各個臟器中。骨骼是礦物質(磷酸鈣)沉積在膠原上形成的。維生素C是合成膠原必不可少的營養成分。如果維生素C極度缺乏,皮膚或黏膜就容易出血,從而引發
壞血病
,同時,骨骼也會變得脆弱。
膠原分子的分子量約30萬,是三股螺旋形的鏈狀結構。三股螺旋鏈在加熱時散開變成單鏈,這樣就成了有彈性口感的明膠,它是製造
肉皮凍
或果凍的原料。如果明膠再進一步分解,就成了分子量是幾千的
膠原肽
,它是一些保健食品的原料。
③ 膠原與原膠原關系
膠原一般指的就是膠原蛋白,或則膠原纖維。
而原膠原是在膠原蛋白形成過程中,一個重要的基本結構,它主要由幾種特定氨基酸構成的三條肽鏈相互纏繞形成,並經過前膠原修飾(可理解為去掉兩端未纏繞部分)形成兩端整齊結構的原膠原。
原膠原形成示意圖
但原膠原形成完成,就可組裝聚合成更大的分子結構 —— 膠原纖維 —— 在形成最終的膠原蛋白。
所以,膠原蛋白實際就是多個原膠原組裝聚合形成的纖維狀具有結構特性的蛋白質!
從這一句話,就可以理解膠原蛋白與原膠原的關系了!
④ 蛋白質的物理;化學性質是什麼
一、物理性質蛋白質是生物體內一種極重要的高分子有機物,占人體乾重的54%。蛋白質主要由氨基酸組成,因氨基酸的組合排列不同而組成各種類型的蛋白質。人體中估計有10萬種以上的蛋白質。生命是物質運動的高級形式,這種運動方式是通過蛋白質來實現的,所以蛋白質有極其重要的生物學意義。人體的生長、發育、運動、遺傳、繁殖等一切生命活動都離不開蛋白質。生命運動需要蛋白質,也離不開蛋白質。營養學上根據食物蛋白質所含氨基酸的種類和數量將食物蛋白質分三類:1、完全蛋白質這是一類優質蛋白質。它們所含的必需氨基酸種類齊全,數量充足,彼此比例適當。這一類蛋白質不但可以維持人體健康,還可以促進生長發育。2、半完全蛋白質這類蛋白質所含氨基酸雖然種類齊全,但其中某些氨基酸的數量不能滿足人體的需要。它們可以維持生命,但不能促進生長發育。3、不完全蛋白質這類蛋白質不能提供人體所需的全部必需氨基酸,單純靠它們既不能促進生長發育,也不能維持生命。根據蛋白質分子的外形,可以將其分作3類1.球狀蛋白質分子形狀接近球形,水溶性較好,種類很多,可行使多種多樣的生物學功能。2.纖維狀蛋白質分子外形呈棒狀或纖維狀,大多數不溶於水,是生物體重要的結構成分,或對生物體起保護作用。3.膜蛋白質一般折疊成近球形,插入生物膜,也有一些通過非共價鍵或共價鍵結合在生物膜的表面。生物膜的多數功能是通過膜蛋白實現的。 二、化學性質 ①具有兩性蛋白質是由α-氨基酸通過肽鍵構成的高分子化合物,在蛋白質分子中存在著氨基和羧基,因此跟氨基酸相似,蛋白質也是兩性物質。②可發生水解反應蛋白質在酸、鹼或酶的作用下發生水解反應,經過多肽,最後得到多種α-氨基酸。蛋白質水解時,應找准結構中鍵的「斷裂點」,水解時肽鍵部分或全部斷裂。③溶水具有膠體的性質有些蛋白質能夠溶解在水裡(例如雞蛋白能溶解在水裡)形成溶液。蛋白質的分子直徑達到了膠體微粒的大小(10-9~10-7m)時,所以蛋白質具有膠體的性質。④蛋白質沉澱原因:加入高濃度的中性鹽、加入有機溶劑、加入重金屬、加入生物鹼或酸類、熱變性少量的鹽(如硫酸銨、硫酸鈉等)能促進蛋白質的溶解。如果向蛋白質水溶液中加入濃的無機鹽溶液,可使蛋白質的溶解度降低,而從溶液中析出,這種作用叫做鹽析.這樣鹽析出的蛋白質仍舊可以溶解在水中,而不影響原來蛋白質的性質,因此鹽析是個可逆過程.利用這個性質,採用分段鹽析方法可以分離提純蛋白質.⑤蛋白質的變性在熱、酸、鹼、重金屬鹽、紫外線等作作用下,蛋白質會發生性質上的改變而凝結起來.這種凝結是不可逆的,不能再使它們恢復成原來的蛋白質.蛋白質的這種變化叫做變性.蛋白質變性後,就失去了原有的可溶性,也就失去了它們生理上的作用.因此蛋白質的變性凝固是個不可逆過程.造成蛋白質變性的原因物理因素包括:加熱、加壓、攪拌、振盪、紫外線照射、X射線、超聲波等:化學因素包括:強酸、強鹼、重金屬鹽、三氯乙酸、乙醇、丙酮等。⑥顏色反應蛋白質可以跟許多試劑發生顏色反應.例如在雞蛋白溶液中滴入濃硝酸,則雞蛋白溶液呈黃色.這是由於蛋白質(含苯環結構)與濃硝酸發生了顏色反應的緣故.還可以用雙縮脲試劑對其進行檢驗,該試劑遇蛋白質變紫⑦蛋白質在灼燒分解時,可以產生一種燒焦羽毛的特殊氣味.利用這一性質可以鑒別蛋白質.三、作用蛋白質在細胞和生物體的生命活動過程中,起著十分重要的作用。生物的結構和性狀都與蛋白質有關。蛋白質還參與基因表達的調節,以及細胞中氧化還原、電子傳遞、神經傳遞乃至學習和記憶等多種生命活動過程。在細胞和生物體內各種生物化學反應中起催化作用的酶主要也是蛋白質。許多重要的激素,如胰島素和胸腺激素等也都是蛋白質。此外,多種蛋白質,如植物種子(豆、花生、小麥等)中的蛋白質和動物蛋白、乳酪等都是供生物營養生長之用的蛋白質。有些蛋白質如蛇毒、蜂毒等是動物攻防的武器。蛋白質占人體的20 %,占身體比例最大的。膽汁,尿液除外,都是蛋白質合成的。只有蛋白質充足,才能代謝正常。就像蓋房子,構建身體的原材料最主要的是蛋白質。1.蛋白質是構建新組織的基礎材料,是酶,激素合成的原料,;維持鉀鈉平衡;消除水腫。2.是合成抗體的成分:白細胞,T淋巴細胞,干擾素等,提高免疫力。3.提供一部分能量。4.調低血壓,緩沖貧血,是紅細胞的載體。5.形成人體的膠原蛋白。眼球玻璃體,視紫質都有膠原蛋白。6.調解酸鹼度。經常吃肉的人呈酸性體質。會出現頭沉---供血不足,吃充足的蛋白質,不讓糖分降低。7.大腦細胞分裂的動力源是蛋白質;腦脊液是蛋白質合成的;記憶力下降8.性功能障礙9.肝臟:造血功能;合成激素,酶;解毒。缺乏蛋白質,肝細胞不健康。有一副好肝臟,人健康就有保障。10.心臟---泵器官。缺乏蛋白質會出現手腳冰涼;缺氧;心肌缺氧造成心力衰竭----死亡。11.脾胃:每天都要消化食物,消化酶是蛋白質合成的。缺乏會造成胃動力不夠,消化不良,打嗝。胃潰瘍,胃炎;胃酸過多,刺激潰瘍面你會感覺到疼,蛋白質唯一具有修復再造細胞的功能。消化壁上有韌帶,缺乏蛋白質會鬆弛,內臟下垂,子宮下垂臟器移位。12.四肢:人老先老腿,缺乏蛋白質肌肉萎縮;骨頭的韌性減低,易骨折13.抗體會減少,易感冒,發燒。⑤ 膠原蛋白分子量的大小有標准數據嗎在多少之間謝謝
有標准數據。
相對分子質量從約2kD至300kD不等。
膠原的相對分子質量大,電泳圖有3條泳帶,在100kD附近出現的2條泳帶分別是膠原分子的α1鏈和α2鏈,在200 kD附近出現的1條泳帶是膠原分子的β鏈。
即膠原的每條多肽鏈相對分子質量可達100kD,1個膠原分子相對分子質量為300kD。多肽分子量的測定方法常用SDS-PAGE,凝膠色譜法以及質譜法。有人採用凝膠過濾色譜法測定脫鉻革屑中膠原水解產物分子量分布在16.1KD左右。
(5)膠原分子的等電點是多少擴展閱讀:
1、膠原蛋白是生物高分子,動物結締組織中的主要成分,也是哺乳動物體內含量最多、分布最廣的功能性蛋白,占蛋白質總量的25%~30%,某些生物體甚至高達80%以上。
2、畜禽源動物組織是人們獲取天然膠原蛋白及其膠原肽的主要途徑,但由於相關畜類疾病和某些宗教信仰限制了人們對陸生哺乳動物膠原蛋白及其製品的使用,現今正在逐步轉向海洋生物中開發。
3、由於氨基酸組成和交聯度等方面的差異,使得水產動物尤其是其加工廢棄物—皮、骨、鱗中所含有的豐富的膠原蛋白具有很多牲畜膠原蛋白所沒有的優點,另外來源於海洋動物的膠原蛋白在一些方面明顯優於陸生動物的膠原蛋白,比如具有低抗原性、低過敏性等特性。因此水產膠原蛋白可能逐步替代陸生動物膠原蛋白。
⑥ 膠原蛋白的提取分離
由於膠原是細胞外間質成分,在體內以不溶性大分子結構存在,並與蛋白多糖、糖蛋白等結合在一起,因此膠原的制備包括材料的選擇、預處理、酸鹼酶鹽水法提取、不同類型膠原的分離和純化。 除膠原蛋白外,動物骨中還含有油脂、多種礦物質和其他雜質,因此在被用於提取膠原蛋白之前必須進行預處理。先剔除動物骨上殘留的肉質和肌腱等雜物,粉碎後用正丁醇或正己烷萃取出骨油。最後除去骨中無機物以提高膠原蛋白的得率。除去骨中的礦物質可用稀酸或EDTA溶液。有人用原料用5倍質量的1.0moL/LHCL脫鈣處理2d,用正乙烷脫脂後再用胃蛋白酶酶解,在加酶量150U/g,pH值1.7,37℃條件下處理120min,然後在固液比1∶6的情況下抽提5h,在此條件下,提取率可達18%;還有人用EDTA溶液(pH7.4)浸泡骨料5d,可有效脫去骨料中的羥基磷灰石。
膠原蛋白的提取一般有三種方法:一是高壓輔助的物理方法;二是用溶劑預處理結合低溫或熱水抽提的化學方法,根據溶劑的不同,可分為熱水浸提法、酸法、鹼法、鹽法;三是用酶的生物化學法。一般來說,高壓輔助和熱水抽提針對明膠的提取,而低溫抽提和酶法針對膠原的提取,但其基本原理都是根據膠原蛋白的特性改變蛋白質所在的外界環境,把膠原蛋白從其他蛋白質中分離出來。
在實際提取過程中,不同提取方法之間往往相互結合,可以得到較好的提取效果。採用超高壓處理系統對原料給予高壓處理一段時間,使其組織結構和膠原蛋白的三股螺旋結構發生鬆弛、變性,便於分離提取。 酸法提取是利用一定濃度的酸溶液在一定的條件下提取膠原蛋白,主要採用低離子濃度酸性條件破壞分子間鹽鍵和希夫鹼,而引起纖維膨脹、溶解,採用酸法提取的膠原蛋白通常成為酸溶性膠原蛋白。酸溶解法可將沒有交聯的膠原分子溶解出來,也可溶解含有醛胺類交聯鍵的膠原纖維,然後釋放到溶劑中。酸法是提取膠原蛋白比較常用和有效的方法,用低溫酸法提取的膠原最大程度的保持了其三螺旋結構,適用於醫用生物材料及原料的制備。通常的做法是將適當濃度的酸液按一定料液比加入到經過預處理的骨粉中,於0~25℃攪拌提取一定時間。在採用酸法進行膠原蛋白的提取時,注意提取溫度不宜過高,以免膠原蛋白的生物活性發生破壞。取樣經前處理後,勻漿在低溫下用酸浸提,離心即可得酸溶性膠原蛋白(acid-soluble collagen,ASC)。作為溶劑使用的酸,主要有鹽酸、磷酸、甲酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸等,但大多數研究集中於乙酸抽提,像Maria Sadowska等用0.5mol/L檸檬酸在室溫下提取骨膠原蛋白,其提取率略低於乙酸提取。檸檬酸因不產生顏色和異味得以廣泛使用於食品工業的膠原蛋白的提取。
酸法處理時,反應強烈,水解徹底,多生成氨基酸混合物,而且使用酸提取時,根據酸濃度、水解溫度、水解時間等條件的不同,可以得到分子量不均的膠原水解物。但是在即使中等濃度酸徹底水解過程中色氨酸也會全部被破壞,絲氨酸和酪氨酸也會部分被破壞,且設備腐蝕嚴重。因此,酸法溶出生物醫用膠原要准確控制酸度、溫度、時間等影響因素。由於各種不足,酸法很少單獨使用,一般和酶法配合。比如以豬皮為原料,在檸檬酸(pH8.6)和胃蛋白酶協同下提取膠原蛋白。在處理後的豬皮中加0.05moL/L含有胃蛋白酶的檸檬酸溶液(pH2.5-3)處理一段時間,然後再用NaCL鹽析,最後提取率為12.35%,提取物保持了完整三股螺旋結構的I型膠原蛋白。還有人以雛雞胸軟骨為原材料,在0.5moL/L醋酸條件下經胃蛋白酶多次消化,在4℃,20000r條件下離心20min,最後應用DEAE-Sephadex A-50進行離子交換層析,之後透析,再用NaCL鹽析,最後得到純化的膠原蛋白Ⅱ型。 鹼法提取即利用一定濃度的鹼在一定的外界條件下提取膠原蛋白,鹼處理法中常用的處理劑為石灰、氫氧化鈉、碳酸鈉等,用氫氧化鈉浸提時效果較好。一般的是把樣品勻漿後,用鹼溶液多次溶脹後,再離心提取。但由於易引起蛋白質變性,如膠原肽鍵水解,含羥基、疏基的氨基酸全部被破壞;所得產物等電點pH值較低,天冬酞胺和谷氨酞胺分別轉變為天冬氨酸和谷氨酸,得到的水解產物分子量較在酸性溶液中比低等問題,若比較嚴重的話,還會產生 D、L-型氨基酸消旋混合物,若D型氨基酸含量高過L 型氨基酸,則會抑制L-型氨基酸的吸收,有些D型氨基酸有毒,甚至有致癌、致畸和致突變的作用。而且鹼法提取的含量較低,用氫氧化鈉從魷魚皮中提取鹼溶性膠原蛋白,其得率只有3%(以濕基計)。所以,若想提取結構完整、使用安全的膠原蛋白,很少採用此方法。有關單獨採用鹼法提取膠原蛋白的報道不多,一般是鹼法提取和酸法提法結合使用。比如在4℃條件下,魚骨用0.1moL/L的NaOH浸泡6h,再用2.5%NaCl浸泡6h去除雜蛋白,用10%的異丙醇溶液去除脂肪,0.1moL/L的檸檬酸浸泡3d,最後得到無色無味的膠原蛋白,提取率為11.87%。
注意,無論酸法或鹼法,均可有效地提取膠原蛋白,有人分別採用醋酸- 鹽酸的混合酸液(pH3.0)和NaOH溶液(pH12.0)提取骨膠原蛋白,提取率基本相當。但是,這兩種方法提取膠原蛋白不僅容易影響膠原蛋白的生物活性,而且提取後產生的酸性或鹼性廢液必須進行適當處理,以避免對環境造成污染。 酶法提取是指可溶性膠原和酸溶性膠原被提取後,需用一些蛋白酶,如膠原酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等水解,得到不同的酶促溶性膠原蛋白。所使用的蛋白酶主要分3種:動物蛋白酶(如胰蛋白酶,胃蛋白酶),植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶,菠蘿蛋白酶),微生物蛋白酶(如鹼性蛋白酶,中性蛋白酶)。在對酶法水解膠原蛋白的研究中,以鹼性蛋白酶應用最多。
將膠原進行限制性降解,即將末端肽切割下來,由於膠原肽鏈間的共價鍵都是通過分子末端肽里的賴氨酸或羥賴氨酸的相互作用形成的,末端肽被切下後,含三螺旋結構的主體部分可溶於稀有機酸而被提取出來。用酶處理,可以水解掉膠原纖維蛋白的末端肽,提高膠原蛋白的產率;而且還不會破壞膠原蛋白的三股螺旋結構,保持其特性。影響酶提取的因素有很多,如酶濃度、酶與底物的比例、酶解時間、酶解溫度、pH值以及料液比等。在實際操作中,大多數採用酶復合法提取膠原蛋白,較多的是使用胃蛋白酶提取,有機酸多為乙酸。
酶解膠原蛋白的工藝主要分為單酶水解法和多酶水解法。多酶水解法又分為混合酶水解法(比如牛胰蛋白酶,鏈黴菌蛋白酶,芽孢桿菌蛋白酶混合)和分步酶水解法,酶法提取皮膠原具體實驗工藝及條件的選取通常應考慮要開發的產品對分子量的要求,要得到分子量較小的膠原多肽一般採用多酶水解法。影響酶解效果的因素主要有:酶的種類、加酶量、酶解溫度、酶解時間、pH值及料水比。採用酶法提取骨料中的膠原蛋白,既能有效縮短提取時間,又能獲得具有良好生物活性的膠原蛋白,而且對環境的污染也較小。膠原蛋白不易被普通蛋白酶水解,但能被動物膠原酶斷裂,斷裂的碎片自動變性後可被普通蛋白酶水解。胃蛋白酶水解膠原蛋白的適宜條件為pH 1.65~1.70、溫度37℃。
有人以豬骨為原料,用蛋白酶的酶解反應代替傳統制膠工藝,對骨膠原的酶解反應與酶法制膠工藝進行了試驗研究。結果表明:以胃蛋白酶對骨膠原的提取率最高(46.14%),其次是胰蛋白酶(43.42%),接下來是中性蛋白酶(30.14%),最後是鹼性蛋白酶(21.15%)。並且通過單因素和正交試驗對胃蛋白酶酶解反應中各主要影響因素進行了優化。試驗結果表明,胃蛋白酶提取的最優條件是,胃蛋白酶的濃度是1%,在pH2.0的條件下酶解48h,然後在濃度為10%(w/v)的NaCL溶液中鹽析24h,最後骨膠原的回收率為64.77%,骨膠原的提取率為49.75%。還有人用胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白,分別在水解0、2、6、10、14、18、22、26h時對四種不同胃蛋白酶用量(分別為1%、2%、2.5%、3%)的試樣取樣檢測,採用一階HILL方程模擬胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白的進程以及胃蛋白酶水解速率的衰減過程,最後得出2%的胃蛋白酶用量和6-7h的水解時間提取率最大。還有人用以新鮮豬皮為原料,在50-52℃的條件下用胰酶進行水解,在酶用量為 5000:1~10000:1,pH值為9,反應2-3h,原料:水為1:2的條件下酶解。結果表明:總蛋白質的提取率≥80%。
採用酶法提取膠原蛋白時,必須嚴格控制提取條件。首先,酶作用時間必須適當。如果時間過短,膠原蛋白就不能充分釋放到提取液中,影響提取率;如果酶作用時間過長,膠原蛋白會水解過度,產生過多的苦味小分子低聚肽,不僅會增加分離純化的難度,也會影響膠原蛋白的功能特性和生物活性。其次,酶解溫度要適宜。溫度過低,酶的作用效果不明顯;溫度過高會引起酶的失活和膠原蛋白的變性。據報道,當介質pH略低於中性時,膠原蛋白的變性溫度為40~41℃,當介質pH為酸性時,膠原蛋白的變性溫度為38~39℃,而且魚皮膠原蛋白的變性溫度要比豬皮膠原蛋白的變性溫度低7~12℃。所以,如果要使提取的膠原蛋白具有良好的生物活性,在提取過程中應使提取溫度低於變性溫度。第三,需選用適當的酶。一般從陸生哺乳動物組織中提取膠原蛋白時,採用胃蛋白酶在其最適作用溫度下進行提取是合理的,但對於魚類等水生動物,由於其膠原蛋白的變性溫度比陸生哺乳動物低,因此許多蛋白酶便不適用,如果在這些酶的最適作用溫度下提取可能會破壞膠原蛋白的某些功能特性和生物活性。採用酶法提取膠原蛋白及其多肽的研究主要是從動物皮及其加工副產物中,應用酶法從動物骨中提取膠原蛋白及其多肽報道較少。 指使膠原分子內部和分子間通過共價健結合提高膠原纖維的張力和穩定性的方法。該法又分為物理方法、化學方法和低溫等離子體法,生物學方法;其中物理方法、化學方法是最常用的交聯改性方法,生物學方法改性膠原蛋白主要在研究有關動物老化的生命現象中涉及,在研製膠原基生物醫學材料中少見報道。
物理方法
通過物理手段對膠原蛋白改性有紫外線照射、重度脫水、λ射線照射和熱交聯等方法。膠原溶液如被紫外線等照射,將在分子間產生交聯,粘度增加,生成凝膠。常用的紫外線交聯膠原膜的方法是將膠原膜放在鋁箔上,距離254 nm紫外燈20 cm高度,照射1~5 h。對紫外線照射的膠原膜進行力學性能和膠原酶試驗表明:交聯膠原膜的萎縮溫度Ts和抗膠原酶解的能力均顯著高於未交聯膠原膜。
重度脫水也是膠原蛋白物理改性中常使用的方法,該法是通過脫水導致膠原分子間交聯,從而增加變性溫度,改善膠原的性能。改性後膠原膜生物相容性提高,降低了水溶性,影響了膜與成骨細胞的生物相容性。物理方法改性原蛋白的優點是可避免外源性有毒化學物質進入膠原內,缺點是膠原膜交聯度低,且難以獲得均勻一致的交聯。
化學方法
化學方法比物理方法改性交聯度高,且能獲得均勻一致的交聯,對調節、控制膠原的各性質均有效。已廣泛應用於各種化學試劑交聯膠原,以提高其交聯度、力學性能及生物相容性。化學改性法具體又可分為使用化學試劑交聯、側鏈的修飾、生理活性物的固定化三種方法。
化學試劑交聯法中常用的化學交聯劑有戊二醛、己異二氰酸酯、碳化二亞胺、疊氮二苯基磷等,其中戊二醛是應用最廣泛的試劑,大量實驗證明:戊二醛能提供有效交聯,但有細胞毒性,且其用量難以控制。另外,隨著交聯度的增加,吸水能力和膨脹度卻會降低。醯基疊氮化物、聚環氧化物或京尼平交聯等,不會引入明顯的毒性,且可獲得理想的交聯效果。所見報道中,多使用單一交聯劑對膠原蛋白交聯改性,但也有使用混合交聯劑的,如為了解決人工心臟瓣膜晚期鈣化問題,篩選出環氧丙烷化學改性戊二醛處理生物瓣的方法,可明顯減低瓣膜組織膠原蛋白末端游離羧基含量。動物實驗表明,經改性後的瓣膜組織能保持較好的組織穩定性和機械抗張強度、免疫原性測試為陰性,符合臨床應用。
側鏈修飾就是對膠原分子側鏈的氨基和羧基進行化學修飾,改善電荷分布,使膠原獲得新的特性,例如將膠原氨基丁二醯化,可變成負電荷豐富的膠原。與未修飾膠原蛋白相比血小板粘附能,血纖維蛋白形成能都弱,有抗栓性;然而如將膠原羧基甲基化獲得的正電荷豐富的膠原,生理條件下血小板粘附能、活化能都高。與交聯改性相比,在生物材料領域,利用側鏈修飾對膠原改性所做的工作還較少。
化學方法雖然可獲得均勻一致的交聯,但存在著引入外源有毒試劑,殘留試劑難清除等缺點。一些報道表明,低溫等離子體技術改性膠原或膠原復合膜可使材料表面引入不同基團,改變材料表面化學組分和結構,從而改變材料的特性,如使之更具有細胞識別位,提高表面能,改善表面極性等。 膠原單獨使用,物理機械性能差(這幾乎是天然材料共有的弱點),性能單一,且因有親水性強,在體內易被膠原酶降解等不可避免的弱點限制了它的應用。但如將膠原與其它物理、化學性質不同的合成或天然高分子共混,組成一種多相固體材料,在性能上膠原與其它高分子互相補充,膠原基「復合材料」的概念由此產生。
已見報道的與膠原共混的合成高分子有不可生物降解的聚甲基烯酸酯及丁烯酸酯、聚氨酯、聚醯胺和可生物降解的聚乙烯醇、聚乳酸、聚谷氨酸、聚乙醇酸等,20世紀80~90年代初最有代表性的是聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA)和聚乙烯醇與膠原共混,其報道集中於復合方法、復合機理、理化及生物學性能、材料表面和整體結構、表面修飾的方法和機理以及水凝膠的溶脹擴散等,尤其是水凝膠制備、作軟組織替代、葯物緩釋等。後來利用可生物降解的聚乳酸、聚乙醇酸、聚酸酐、聚谷氨酸、聚亞乙基四乙酸等與膠原共混改性制備可吸收外科縫線、組織工程支架材料(如組織引導再生材料)的相關研究相對增多。不過合成高分子與膠原蛋白共混復合一些問題,如尼龍等不降解高分子材料不能進行生理代謝,與膠原蛋白復合後只能用做皮膚的外層敷料不能永久代替皮膚,而聚谷氨酸等可生物降解材料,如果相對分子質量小則強度不夠,相對分子質量大難溶於水,溶解時還出現降解,影響材料的機械強度。
天然高分子材料中最具代表性的是天然蛋白質和天然多糖,多糖主要有軟骨素、HA(透明質酸)、殼聚糖、肝素等,多糖復合材料比較集中於可吸收性外科縫線、葯物釋放的載體、皮膚替代物、透析膜、止血劑、醫用引導組織再生材料、骨替代材料、組織培養系統的支架。
⑦ 膠原的分子結構有何特點
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膠原蛋白的
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氨基酸
基構成的α―
肽鏈所組成,其分子量約為30萬。根據α―肽鏈
結構
與組成的不同,可將其
分為由兩種不同的α肽鏈,即由兩條α1(I)肽鏈和一條α2(I)肽鏈所組成
的I型
膠原
和由三條相同α肽鏈所組成的II、III、IV型膠原。它們均具有重復
的三重序列結構(甘氨酸―X―Y)n。X和Y可為不同
氨基酸殘基
的三分之
一。現已闡明:α1(I)鏈具有1056個氨基酸殘基,其中1014個組成連續的
三重體。非
三股螺旋
區部分,稱之為末端肽,所以
分子
有16個N端
殘基
和26個C端肽
構成三股螺旋的伸展部分。α2(I)肽鏈同樣具有構成三重結構的1014個氨
基酸殘基。
原膠原
分子中不含
色氨酸
殘基,
酪氨酸
殘基也
抗原性
很弱,具有優良的
生物相容性
很少。