❶ Collagenase D是否就是Collagenase IV
膠原酶的化學名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構，而不損傷其它蛋白質和組織。膠原酶的化學本質是一種蛋白質，因此，這對溫度、PH和導致蛋白質變性的各種因素均非常敏感，極易受到外界條件的影響而改變其本身的構象和性質。 膠原酶按其存在的方式不同可分為人體內源性膠原酶和葯用膠原酶兩種。人體內源性膠原酶是指人體內部本身所具有的膠原酶，如牙齦、觸膜等上皮組織和關節滑膜、椎間盤內都不同程度的存在著這種膠原酶，它在體內膠原蛋白的分解過程中發揮著不可或缺的作用。葯用膠原酶是指利用生物制葯的高科技手段從溶組織梭狀芽孢桿菌的發酵液中提取、純化並精製而得的白色或類白色無菌凍乾粉針生物制劑。 膠原酶（collagenase）是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結締組織中膠原蛋白成分。當擬消化的組織較硬，內含較多結締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細胞的效果較差，這時可採用膠原酶解離細胞法。 膠原酶僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。因此適於消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%。膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶，要根據所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。 1、膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用於哺乳動細胞的分離。 2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。 3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用於胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞。 4、膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。 膠原酶的配置 膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。 注意： 因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。 鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。 膠原酶的使用 1.將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm3左右小塊 2.將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。 3.將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內，每隔3min振搖一次，如能放在37℃的恆溫震盪水浴箱中則更好。 消化時間與組織的類別很有關系，對於某些腫瘤組織或其他較緻密結締組織，消化時間4~48h，對於容易消化的組織可以採用37℃震盪消化15~45min，也可以根據具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經膠原酶消化後，由於上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。 4.收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用100目不銹鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者無血清培養液離心漂洗1~2次，去除上清，加培養液製成細胞懸液，接種培養瓶。
❷ 膠原酶和胰酶在細胞原代培養中的區別
膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用，作用對象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。消化原代培養的上皮類細胞用此酶效果更好。
胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應用的消化劑.胰蛋白酶是一種胰臟製品,對蛋白質有水介作用,主要作用於賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開,在常用的蛋白酶中由於產品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的作用,取決於細胞類型、酶的活力、配製的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等.
膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶,對膠原有很強的消化作用.適於消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細胞間質有較好的消化作用,對細胞本身影響不大,可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害.該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養液配製,即操作簡便又可提高細胞成活率,最終濃度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無需機械振盪,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本.
❸ 原代細胞是如何培養的選擇組織塊還是消化液培養法
原代培養即直接從有機體取下細胞、組織或器官，讓它們在體外維持與生長。原代培養的特點是細胞或組織剛離開機體，它們的生物性狀尚未發生很大的改變，在一定程度上可反映它們在體內的狀態，表現出來源組織或細胞的特性， 因此用於葯物實驗，尤其是葯物對細胞活動、結構、代謝、有無毒性或殺傷作用等，是極好的工具。
那麼，原代細胞是如何培養的呢？
常用的原代培養法有組織塊培養法和消化培養法。
（一）組織塊培養法
許多實驗室喜歡用組織塊培養法進行原代培養，因為方法簡單，細胞也較容易生長。尤其是培養心肌，有時還可觀察到心肌組織塊搏動。細胞從組織塊邊緣向外長出並鋪滿培養皿或培養瓶後， 即可進行傳代。
1. 設備材料
培養箱、冰箱、超凈工作台／無菌間、無菌吸管、離心管、酒精燈、試管架、培養瓶、培養皿、消化液、基礎培養液、胎牛血清、Hanks 溶液、雙抗試液、剪刀、攝子、小燒杯。
2. 操作步驟
（1） 在無菌條件下，取待培養的組織適量，置入小燒杯中， 以適量Hanks 溶液清洗2~3 次，去掉組織塊表面的血污。
（2）用眼科剪將組織塊反復剪成0.5~ 1mm3的小塊。
（祥鏈3）再用Hanks 溶液反復漂洗， 直至液體不混濁為止。等組織塊下沉，將燒杯傾斜，用小吸管盡量吸除Hanks 溶液。
（4）用含20%滅活血清及雙抗溶液(200U/ml 青黴素、200μg/ml 鏈黴素）的培養液再清洗，用吸管吸干後加入5ml 含20％血清的培養液。
（5）用彎頭吸管吸取組織小塊，均勻地置於培養皿內表面，吸去多餘的培養液，各組織小塊之間相距0.5cm 為宜。蓋好培養皿蓋，做好標記， 置37°C 的CO2培養箱內。
（6） 2~4h 後，於超凈工作台中，緩緩地向培養皿中加入上述含20％血清及雙抗溶液( 100U/ml 青黴素及100μg/ml 鏈黴素）的培養液少量，以使組織塊浸沒在培養液中。
（7）輕輕地將培養皿及組織塊移至CO2培養箱， 如無特殊情況，不必觀察。1~2 周後，可觀察到細胞從組織塊邊緣長出，形成生長暈。
（9） 一般說來，若培養液無明顯改變， 1 周換液1 次即可。待細胞長滿整個培養皿內表面，即可進行傳代培養。
3. 需要說明及注意的問題
（1） 如果是用培養瓶而不是培養皿，則接種組織塊千培養瓶底壁後， 要輕輕地翻轉培養瓶，令瓶底在上，蓋好瓶蓋後輕輕置入37°C 的CO2培養箱， 2~4h 後，取出培養瓶，在超凈工作台內打開瓶蓋，仍令組織塊在上方。在組織塊對面瓶壁加入適量上述培養液。然後，輕輕翻轉培養瓶，讓組織塊浸沒於培養液中。蓋好瓶蓋後放回二氧化碳孵箱，繼續培養。
（2） 從培養皿表面游離下來的組織塊，棄去即可。
（3） 如果使用玻璃培養瓶，而不是新的塑料培養瓶，則最好在玻璃底表麵包被大鼠鼠陵基尾膠原，這樣不但有利於組織塊的黏附，而且可使細胞生長得更好。
（4）本方法適於各種組織的培養，操作者還可根據自己的實驗需要和細胞種類加以修改。
（二）消化培養法
它與上述組織塊培養法的主要區別有2 點。一要用酶制劑（最常用的是胰蛋白酶）處理組織塊，除去細胞間質，使細胞相互分離，形成細胞懸液；二細胞生長方式多為單層( monolayer ) 。本方法的優點在於單層細胞更易攝取營養、排出代謝產物，因此生長較快，可較快地應用於實驗研究 ； 缺點是步驟頗尺宴謹為繁瑣，操作不慎易污染 。此外，消化處理要恰到好處，不然對細胞會有一定的損傷作用。
1. 操作程序
（1） 在無菌條件下， 取待培養的組織1cm3左右，置入平皿或燒杯中，以適量Hanks 溶液消洗3 次，去掉組織塊表面的血污及結締組織。
（2）以鋒利的眼科剪將組織塊反復剪碎，得到約0.5mm x 1mm 大小的小塊。
（3）以Hanks 溶液沖洗數遍，稍候組織塊下沉，吸除Hanks 溶液。
（4）用少量Hanks 溶液，將組織小塊吸入預先置有無菌的磁力攪拌子的錐形燒杯中，再加入15~30ml 上述胰蛋白酶消化液。
（5）將錐形燒杯用橡皮塞蓋緊，外封以錫箔。然後移至預先置入37°C 培養箱內的電磁攪拌器上。
（6）打開攪拌器的電源開關，使攪拌子旋轉， 關好培養箱，讓胰蛋白酶進行消化。
（7）在消化過程中，每隔一定時間吸取消化物滴於載片上，於光學顯微鏡下觀察，檢查細胞是否分散成單個。若大部分細胞已分散，立即加入適量Hanks 溶液，終止消化。通常需消化10~20min 。
（8）先以100μm 不銹鋼篩過濾，濾去未消化的組織塊或大細胞團（如獲得的細胞量少，這些組織塊可繼續進行消化，以便取得較多細胞）。繼以20μ 不銹鋼篩過濾。
（9）將取得的濾液進行低速（每分鍾500~ 1000 轉）離心5min，吸除上清液。並用Hanks 溶液離心清洗1~2 次，最後加入含血清的培養液，攪勻，製成細胞懸液。
（10）用計數板計數，確定細胞懸液濃度，通常以1×105~3×105個接種於培養瓶或培養皿中。
2. 需要說明及注意的問題
（1） 用何種酶進行消化可視所培養細胞而定，除胰蛋白酶外，常用1 型膠原酶消化睾丸支持細胞、血管平滑肌細胞和內皮細胞；用II 型膠原酶消化大鼠腺垂體細胞等。
（2）如果沒有不銹鋼篩， 可用4 層紗布代替，但紗布要預先經高溫高壓滅菌。
（3） 嚴格地說，原代培養是指未經傳代的細胞，但在實際工作中，人們常將10 代以內的細胞用作原代培養細胞，因為此時的細胞基本上保持著原有的生物學特性。
（4） 從原代培養的操作步驟不難看出，原代細胞中含有多種細胞成分，即它們是異質型( heterogeneity) 的群體，因此在設計實驗及分析結果時，切勿忘記這一因素。
❹ 動物細胞培養中，胰蛋白酶和，膠原蛋白酶有什麼用
胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應用的消化劑.胰蛋白酶是一種胰臟製品,對蛋白質有水介作用,主要作用於賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開,在常用的蛋白酶中由於產品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的作用,取決於細胞類型、酶的活力、配製的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等. 膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶,對膠原有很強的消化作用.適於消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細胞間質有較好的消化作用,對細胞本身影響不大,可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害.該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養液配製,即操作簡便又可提高細胞成活率,最終濃度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無需機械振盪,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本.
❺ 膠原酶消化用什麼濃度edta終止
膠原酶消化用血清或者含血清的培養基終止。膠原酶一般濃度在百分之0.2左右，使用它來消化細胞滑差時，注意它能顯著影響pH值，而且在弱鹼性條件下才易溶，而且不能被終和。終止是用血清蛋白，血頌明清含有野讓告非特異性胰蛋白酶抑制劑。保存於負20度。