① 請教大鼠原代肝細胞的分離和培養的問題
我記得好像有這一方面的的論文，題目都一樣的《大鼠原代肝細胞的分離與培養》是徐麗娜 鞠雷 顧憲銳 張恆 馬玉忠 河北農業大學動物科技學院的
http://www.cqvip.com/qk/96216X/200712/26163977.html
你下載來看就行了（不過下載要錢）
下面我給你，我做的一個過程（僅做參考）
我做的就是大鼠原代肝細胞，養了一段時間了，下面是我的實驗步驟，希望對你有所幫助。
1）3-5天乳鼠，斷頭處死，75%酒精浸泡3-5分鍾。
2）移入超凈台內，無菌取下肝臟，放入冷PBS內，撕下被膜等。
3）移入25ml燒杯內，剪成1mm3左右大小，PBS清洗至上清無色。
4）移入三角瓶內，加5倍量0.05%胰酶37度消化20分鍾。
5）終止消化，靜置，棄上清。加0.05%膠原酶消化20分鍾。
6）100目過濾。離心，800，3分鍾。
7）計數，調整濃度，接種。24小時第一次換液，以後沒兩天換一次液，4、5天可以鋪滿。
二、方法
1．傳統門靜脈灌流消化法（傳統門脈灌流法）：參照鄒氏等文獻方法[3,4,5]。
2．低濃度膠原酶原位循環灌流法：
2.1取Wistar大鼠，用2%戊巴比妥鈉10mg/100g體重、肝素20 u/100g體重分別腹腔注射以麻醉和抗凝。
2.2 10-15分鍾後固定大鼠，75%酒精消毒，紫外燈照射15-30分鍾。腹部再次75%酒精消毒後正中切開打開腹腔並更換器械。
2.3顯露肝門部門靜脈並游離2-3cm；顯露游離肝下下腔靜脈2-3cm，各置一結扎線，暫不結扎。
2.4穿刺針插入門靜脈後立即結扎固定，盡快接通硅膠管並啟動蠕動泵（無泵時，輸液器亦可），同時剪斷肝下下腔靜脈遠端。
2.5用D-Hanks液20-30ml/min快速灌注清除肝內血液，1分鍾內即可見肝臟顏色變淺，持續灌注10分鍾至肝臟呈米黃色。同時切開胸腔結扎肝上下腔靜脈。
2.6插另一硅膠管入肝下下腔靜脈並結扎固定，換D-Hanks液為膠原酶消化液(370C預熱)循環灌注消化，灌流速度為10-20ml/min，持續時間10-20分鍾至肝質變軟，壓之凹陷不易恢復。
2.7停止灌注，小心剪取各肝葉置入消毒平皿內，加入適量肝細胞洗滌液（4oC預冷），撕碎肝臟並祛除纖維結締組織，製成混合肝臟細胞懸液。
2.8 100目篩網過濾入50ml離心管，500rpm離心1-2分鍾。去上清，沉澱加入RPMI 1640 （4oC預冷）20-30ml洗滌3次。
2.9肝細胞沉澱加入肝細胞培養液重懸為10ml，取適量計數並用0.4%台盼藍染色判斷存活率。後即可按實驗設計接種培養
我們目前正在做大鼠肝臟細胞的分離培養（原位循環灌注法），我把大體步驟和大家交流一下。
1，動物稱重，戊巴比妥麻醉。
2，固定，消毒，腹部正中十字切口，或者「U」型切口進腹。
3，分離門靜脈和肝下下腔靜脈，分別插管，從門靜脈注入肝素，使大鼠全身肝素化。
4，阻斷肝上下腔靜脈（位置較深，分離結扎有難度，可用哈巴狗血管夾夾住，亦可用消毒棉簽壓迫）
5，從門靜脈內注入D-HANKS，直至肝下下腔靜脈插管內流出來的液體中不含或含少量紅細胞，肝臟呈米黃色。
6，此時接上自製的膠原酶循環灌注裝置（循環通路：門--肝--肝下下腔--蠕動泵--門），灌注15分鍾左右，到肝臟表面呈顆粒狀為止。
7，取下肝臟，剪碎，去結締組織，放入含有膠原酶的三角瓶中繼續水浴消化10分鍾後加入HANKS 或者1640終止消化。
8，將3角瓶帶入超凈台內，在超凈台內完成以下步驟。
9，50目篩網，200目篩網，1640兩次吹打過濾。獲得細胞懸液。
10，1640洗滌離心3次，收集細胞，製成一定濃度的懸液。
11，計數，調整濃度，培養。
（大體步驟，太多細節不贅述，我們曾用此方法分離乳豬，大鼠的肝細胞，結果令人滿意）
注意點：
1，腹部切口位置要合適，避免誤入胸腔導致大鼠死亡。
2，插管要固定，避免滑脫。
3，阻斷肝上下腔可以用小哈巴狗，但我們實際發現用下毒棉簽壓迫更為簡單，效果也令人滿意。
4，所有灌流液均要預熱。
5，肝臟消化完畢後，立即拿到超凈台內操作，注意無菌觀念。
6，消化時間8宜過長。
7，組織塊比較大，通過50目篩網有困難時，可用消毒注射器活塞輕輕擠壓組織塊，勿研磨！
優點：
1，消化充分，且節約膠原酶。膠原酶比較昂貴 ：）
2，在肝臟離體之前大鼠保持呼吸心跳，從而最大限度的保持了細胞的活力。
缺點：
需要一定的手術技巧，了解肝臟循環結構，且血管插管有一定難度。
② 膠原酶和胰酶在細胞原代培養中的區別
膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用，作用對象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。消化原代培養的上皮類細胞用此酶效果更好。
胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應用的消化劑.胰蛋白酶是一種胰臟製品,對蛋白質有水介作用,主要作用於賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開,在常用的蛋白酶中由於產品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的作用,取決於細胞類型、酶的活力、配製的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等.
膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶,對膠原有很強的消化作用.適於消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細胞間質有較好的消化作用,對細胞本身影響不大,可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害.該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養液配製,即操作簡便又可提高細胞成活率,最終濃度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無需機械振盪,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本.
③ 肝細胞培養
④ 雞原代肝細胞分離時需要多少組織
原代培養心肌細胞作為一種主要的研究模型，被廣泛應用於心血管研究之中.我們實驗室經過長期嘗試，摸索出了一些行之有效的方法，並積累了一些經驗，現總結如下：
1新生大鼠鼠齡的選擇新生大鼠心肌細胞在出生後3 d內具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌細胞則為終末分化細胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生時間越短，其心肌細胞分離後成活率越高，越容易貼壁生長.大量觀測表明，選擇1~3 d齡大鼠分離其心肌細胞進行原代培養較為理想.其中尤以半日齡大鼠心肌細胞培養效果最佳.
2消化酶的選擇及使用
新生大鼠心肌細胞的分離可採用組織塊法和消化法，前者因不易獲得密度均一的細胞且難控製成纖維細胞的生長而較少採用.消化法中常使用的酶有3種：胰蛋白酶、膠原酶I或Ⅱ以及透明質酸酶.透明質酸酶多與胰蛋白酶或膠原酶聯合應用.胰蛋白酶作用較強，容易造成心肌細胞損壞.膠原酶作用較緩和，能消化細胞間質中的膠原纖維以釋放細胞，對細胞損傷小，且在新生大鼠心肌組織，以膠原I為主,故我們選用膠原酶I.文獻報道膠原酶的工作濃度一般在0.6~1 g?L1,我們使用的為0.8 g?L1.膠原酶最好現用現配.
3消化程度的把握
新生大鼠心肌細胞對酶消化極為敏感.消化過度可使肌原纖維出現萎縮，細胞死亡率增加或喪失貼壁能力及搏動能力;消化不足，細胞聚集成團，無法分清細胞邊界，難以形態學觀測.消化過程中使用磁力攪拌器時應注意1)轉速一般控制在60~80 r?min1左右.(2)每次消化的時間須結合消化酶濃度確定.(3)將粘附在攪拌子上的心肌組織吹散，使酶液充分接觸組織.(4)適宜溫度為35~37℃.(5)當組織由紅轉白呈半透明狀態時，應停止消化.
4接種的細胞密度
心肌細胞接種密度不僅影響細胞間的相互接觸，進而影響細胞對肥大刺激的反應，而且影響長期培養細胞的成活率.接種細胞的絕對數量應經精確計算.一般而言，應根據實驗的觀測目的決定單位面積上的細胞數量.例如，如作形態學觀測,六孔板中每孔的接種細胞數量應控制在1×105~2×105個;若需收獲心肌細胞作mRNA或蛋白表達水平的觀測，則每孔的接種密度可增加到5×105~6×105個.
⑤ 原代肝細胞培養問題
原代肝細胞很容易貼壁生長，4小時肯定能貼壁。
「然後就有渾濁的沉澱，那個沉澱是肝細胞吧？」將此沉澱用培養液或pbs稀釋，加台盤藍染色，顯微鏡下觀察，若為活細胞，通常就是肝細胞了，要培養好，最好有大於85%以上的活性。
原代肝細胞最好生長在鼠尾膠原上，也就是用鼠尾膠原鋪板，然後再普細胞。
4小時後換液，然後每20小時左右換液，通常原代肝細胞難以增值，但是維持20天左右沒問題。
⑥ Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶有什麼區別
膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用於哺乳動細胞的分離。
膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。