1型膠原酶加多少

Ⅰ Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶有什麼區別

膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用於哺乳動細胞的分離。
膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。

Ⅱ 膠原酶的配置

膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。
注意：
因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。
鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。

Ⅲ 腫瘤細胞消化液中膠原酶、透明質酸、DNA酶配合什麼比例比較好膠原酶用哪個型的謝謝您的關注和回答

不同腫瘤組織 其中各種蛋白種類、比例各不相同，則相應消化酶的種類和比例也可適當改變，若要制備腫瘤懸液，個人推薦 先查找中英文文獻，參考文獻中的消化方法

Ⅳ Collagenase D是否就是Collagenase IV

膠原酶的化學名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構，而不損傷其它蛋白質和組織。膠原酶的化學本質是一種蛋白質，因此，這對溫度、PH和導致蛋白質變性的各種因素均非常敏感，極易受到外界條件的影響而改變其本身的構象和性質。 膠原酶按其存在的方式不同可分為人體內源性膠原酶和葯用膠原酶兩種。人體內源性膠原酶是指人體內部本身所具有的膠原酶，如牙齦、觸膜等上皮組織和關節滑膜、椎間盤內都不同程度的存在著這種膠原酶，它在體內膠原蛋白的分解過程中發揮著不可或缺的作用。葯用膠原酶是指利用生物制葯的高科技手段從溶組織梭狀芽孢桿菌的發酵液中提取、純化並精製而得的白色或類白色無菌凍乾粉針生物制劑。 膠原酶（collagenase）是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結締組織中膠原蛋白成分。當擬消化的組織較硬，內含較多結締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細胞的效果較差，這時可採用膠原酶解離細胞法。 膠原酶僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。因此適於消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%。膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶，要根據所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。 1、膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用於哺乳動細胞的分離。 2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。 3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用於胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞。 4、膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。 膠原酶的配置 膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。 注意： 因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。 鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。 膠原酶的使用 1.將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm3左右小塊 2.將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。 3.將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內，每隔3min振搖一次，如能放在37℃的恆溫震盪水浴箱中則更好。 消化時間與組織的類別很有關系，對於某些腫瘤組織或其他較緻密結締組織，消化時間4~48h，對於容易消化的組織可以採用37℃震盪消化15~45min，也可以根據具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經膠原酶消化後，由於上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。 4.收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用100目不銹鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者無血清培養液離心漂洗1~2次，去除上清，加培養液製成細胞懸液，接種培養瓶。

Ⅳ 脂肪幹細胞的材料和方法

1.1 實驗儀器與材料
倒置熒光顯微鏡(IX71, Olympus);數字彩色攝像系統(Sony3CCD);圖像分析軟體(Image-pro-plus);離心機(Z23, Herm 德國);Transwell (3450-clear, corning, Costar 美國);純水機(Millipore-Q-Synthesis, Millipore Ltd.法國);六孔板(Corning Incorporated 3516, Costar 美國)。
DMEM 培養基陵神模(高糖，GIBCO 公司);胰酶(GIBCO 公司);乙二胺四乙酸鈉(上海試劑一廠);胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司);Ⅰ型膠原酶(Sigma 公司);油紅O(Sigma 公司);地塞米松(Sigma 公司);胰島素(Sigma 公司);吲哚美辛(Sigma 公司);異丁基甲基黃嘌呤(Sigma公司)。
實驗所採用的脂肪組織均來源於大連沙醫生美容醫院，並徵得患者同意。
1.2 脂肪細胞培養
將吸脂來源的脂肪組織用D-Hanks 沖洗，去除殘留的血細胞和組織碎片，把脂肪組織放入離心管中，記錄原始體積。向組織中加入等體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，放入37℃氣浴振盪器中消化30 min。然後將消化好的組織靜置5 min，待其瞎帆分層後，用吸管吸取位於懸液上層的脂肪細胞，將含有脂肪細胞的懸液以1000 r/min(167g)，離心2 min 後棄掉下層懸液得到脂肪細胞。
1.3 脂肪幹細胞的分離和培養
參照文獻，同上述脂肪細胞的分離一樣，將脂肪組織沖凈，稱重後消化。當消化完成後，棄掉上層未消化的脂肪組織，將下層的細胞懸液以1500 r/min(375g)，離心10 min 後棄上清，得到離心管底部的脂肪幹細胞團，將其重懸，密度調整到1×105mL-1，然後接種在培養面積為25 cm2 的細胞培養瓶中。
當幹細胞長滿培養瓶後按一傳二進行傳代，具體的傳代方法是：首先，用D-Hanks 沖洗一遍細胞，然後加入2 mL 的混合酶溶液(0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化，當在顯微鏡下觀察到細胞發生明顯的變形，縮成球狀後，立即用含有10%胎牛血清尺緩的培養基中止消化，並用吸管輕輕吹打瓶底部，確保細胞完全脫落分離到懸液中，再把細胞懸液置於離心機上，以1000 r/min (167g)，離心5 min。最後，將離心得到的細胞團重懸，調整密度為合適密度進行接種。
1.4 脂肪幹細胞和脂肪細胞的共培養
將准備好的脂肪幹細胞和脂肪細胞分別置於Transwell 的上室和下層中，脂肪幹細胞與脂肪細胞的個數之比分別為1:5，1:1，2:1 和5:1(4 組分別命名為A、B、C 和D 組)進行共培養，其中每孔中脂肪細胞的數量均為1×105 個。以上每組均做平行實驗(n=3)。
1.5 成脂誘導對照實驗
將幹細胞以1.5×105 每孔的密度接種在六孔板中，以正常培養基培養的樣本為成脂分化實驗陰性對照組，以成脂誘導培養基培養的樣本為陽性對照組。具體方法是：向基礎培養基(DMEM+10%胎牛血清)中加入1 μmol/L 的地塞米松、10 μmol/L 的胰島素、200 μmol/L 的吲哚美辛和0.5 mmol/L 的異丁基甲基黃嘌呤，配製成脂誘導培養基，每周換2 次液，直到進行成脂染色觀察為止，以上對照組均做平行實驗(n=3)。
1.6 油紅 O 和台盼藍復合染色
用 0.5%油紅O，對成脂誘導後的各組樣本進行染色。具體操作方法是：先用D-hanks將樣本細胞沖洗充分，然後加入油紅稀釋染色10~15 min，(油紅O 稀釋液配製方法:0.5%飽和油紅O 原液按3:2(油紅O:蒸餾水)加入蒸餾水，然後過濾，待用)，接下來用75%的乙醇溶液將樣本分化至間質清晰，然後蒸餾水沖，最後再用台盼藍對脂質以外的細胞核部分進行復染，並於100 倍鏡下觀察拍照。以每組樣本隨機選取5~10 視野進行拍照觀察以考察共培養方法的成脂誘導分化效果。
1.7 流式檢測
通過酶消化法將細胞收集到離心管中，細胞懸液調整密度為1×105 mL-1，800r/min(120g)，離心5 min，棄掉上清，用4℃的冷D-Hanks 沖洗重懸細胞，再次將細胞懸液以800 r/min，離心5 min，之後棄去上清。然後用D-Hanks 將細胞重懸至1 mL，加入抗體5~10 μL，避光，冰上放置30 min。用D-Hanks 沖洗，離心，棄上清，重復該沖洗過程2~3次，確保將未結合抗體除凈最後，加入約200 至300 μL 的D-Hanks 製成懸液，用流式細胞儀檢測。
1.8 Hoechst/PI 死活染色
棄掉舊培養基，用D-Hanks 沖洗除去殘留培養基然後向每個Transwell 孔中加入質量濃度為1 mg/mL 的Hoechst 33342 大約10 μL，使其終質量濃度為10 μg/mL，37℃下避光反應10 min。待Hoechst 染色完成後，用D-Hanks 沖洗除凈殘余的Hoechst 染料接下來，再加入用PI 染液，使其終質量濃度為10 μg/mL，4 ℃下避光反應15 min，染色完成也用D-Hanks沖凈殘余染液最後，將染好的細胞置於倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。
2 結果與討論
所示的脂肪細胞，與文獻中描述的脂肪細胞相一致，圖中所示的脂肪幹細胞與文獻中描述的相一致。均形態完整，生長狀態良好，適合進行共培養的後續研究。為成脂誘導陰性對照組，表明脂肪幹細胞不能自發生成脂質;圖為成脂陽性對照組，在成脂誘導劑作用下，脂肪幹細胞能夠生成脂質，經統計約有20.3%的脂肪幹細胞發生了成脂分化。為共培養後脂肪幹細胞染色圖片，其中脂肪幹細胞與脂肪細胞之比分別為1:5，1:1，2:1 和5:1(其中每孔中的脂肪細胞數均為1×105 個)，盡管在不同比例下對脂肪幹細胞和脂肪細胞進行tranwell 間接共培養，然而經過8 天共培養後，脂肪幹細胞並不能象成脂陽性對照組那樣產生脂質油滴。
此實驗結果的原因可能是由於共培養的持續時間過短所致。據文獻報導，成脂誘導分化的持續時間通常在1~2 周，即7~4d 左右。因此，有可能由於本實驗中脂肪細胞與脂肪幹細胞共培養時間過短，導致脂肪幹細胞與脂肪細胞沒能得到充分作用，所以不能實現成脂誘導分化。
基於上述分析，需延長共培養時間至20d，進一步考察共培養方式中幹細胞成脂分化的可行性。
為脂肪細胞與脂肪幹細胞經過20d 共培養後脂肪幹細胞的Hoechst/PI 死活染色結果。Hoechst 染料對活的細胞具有特異性染色的特點，PI 則對死細胞特異性染色。從中可以看到，兩組中的細胞均呈明亮的藍色，說明細胞的活性很好。基本上看不到PI 染成紅色的死細胞的存在。表明，本實驗中，經過共培養後的脂肪幹細胞，仍擁有良好的活性。
研究可以發現，共培養組a，d，g 3 組均未發生明顯的成脂分化現象。通過觀察b，e，h 3 幅圖發現，經過成脂誘導劑誘導的3 個不同接種密度的陽性對照組中均出現成脂分化，圖中可以看到成脂分化後的細胞內出現大量密集在一起的小脂滴，當小脂滴達到一定數量後，就會聚合成為較大脂滴。這些成脂分化的現象與文獻中報道的脂肪幹細胞成脂分化的過程相一致。通過觀察c，f，i 3 組未加任何誘導劑，僅僅使用基礎培養基培養的脂肪幹細胞的陰性控制對照組，可以看到，脂肪幹細胞均勻生長於培養界面上，經過20d 的培養細胞的生長狀態良好，未發生明顯細胞破碎和衰退死亡的改變。
a，b，c 和d 為各個共培養組的對照組的流式結果圖，圖e，f，g 和h 為共培養20d 後，脂肪幹細胞的表面標記表達流式檢測結果。
通過分析可以看到，不同脂肪幹細胞與脂肪細胞共培養比例下，共培養組B(共培養比例為1:1)和共培養組C(共培養比例為2:1)的流式結果，與相應的控制對照組B 和組C 相比，CD105 的表達發生下降(b,f,d,h)，CD105 表達分別是，共培養組B 為4.8%，對照組B 為12.4%;共培養組C 為1.3%，對照組C 為6.8%。而另外一個間充質細胞的特異性表面標記CD44，(a,c,e,g)，共培養組B 中為2.9%，對照組B 中為3.1%，沒有顯著變化;在另一共培養組C 中為0.9%，對照組C 中為5.4%，發生顯著變化。
通過以上分析發現(f,g)，經過共培養的脂肪幹細胞，其表面抗原CD105的表達發生明顯的降低，其結果接近不表達。CD105作為間充質細胞特異表達的表面抗原發生這一改變意味著，脂肪幹細胞在共培養過程中可能發生了一定程度上的分化。
3 結 論
採用人體吸脂來源的幹細胞與脂肪細胞進行共培養，8d 之內不能促使脂肪幹細胞成脂分化。且將共培養時間延長至20d 後，仍未能觀察到脂肪幹細胞發生明顯的成脂分化現象。通過流式細胞儀對共培養的脂肪幹細胞進行細胞表面抗原標記表達的分析，發現共培養後脂肪幹細胞與非共培養對照組相比較，其中間充質細胞特異性表達標記CD105 發生明顯降低，這就意味著本實驗的共培養過程中，脂肪幹細胞內部已發生一定程度的改變。

Ⅵ 上皮細胞培養應該注意什麼

上皮細胞培養 1)表皮細胞培養 1.取材：取外科植皮或手術殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產流產兒皮膚更好，切成0.5～1 平方厘米小塊。 2.EDTA 處理：先置入0.02%EDTA 中室溫置5 分鍾。 3.冷消化：換入0.25%胰蛋白酶中，置4℃過夜。 4.分離：取出皮膚，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開。 5.溫消化：取出表皮單獨處理，用剪刀剪成更小的塊後，返頃游置入新的0.25%胰蛋白酶中，37℃再消化30～60 分鍾。 6.用吸管輕輕反復吹打，使成細胞懸液。 7.培養液：通過80 目不銹鋼紗網濾過後，低速離心，吸上清，直接加入Eagle液和20%小牛血清，製成細胞懸液，接種入碟皿中，CO2 溫箱培養。 2) 乳腺組織培養 直接培養法：(適於培養含纖維少的軟組織) 1.在含有少量培養液或Hanks 液的容器中，用鋒利刀片將組織反復切割成碎塊。 2.把組織碎塊連同液體注入離心管中，再補加少許培養液，用吸管吹打片刻，置試管架3～5 分鍾。吸除上層液可排除非乳腺細胞部分。重復2～3 次。 3.末次處理結束後，向沉降管中再補加培養液，用吸管稍吹打，使沉降物重懸。不待細胞團塊下降立即通過3～4 層無菌紗布濾入另管中。 4.調整好適宜密度，接種入培養瓶中培養。 膠原酶消化法：(適於處理含纖維多的較硬組織) 其過程與培養其它組織相同。 3) 胃上皮細胞培養 1.取材：取胃潰瘍或胃癌手術切除胃標本遠端非病變區粘膜少許。 2.清洗：用含慶大乎弊黴素(400 微克/毫升)和二性黴素(2 微克/毫升的Hanks)液漂洗後，用鈍器剝離下粘膜，剪成1mm3 大小。 3.消化：在I 型膠原酶和透明質酸酶中，於37℃中消化80 分鍾。 4.離心：收集細胞懸液，800 轉/分離心後，Hanks 液漂洗兩次。 5.接種：末次離心後加入含有1%～2%胎牛血清的完全培養基，接種入不同孔數的培養板中，接種量依不同實驗目的而定。 4) 肝細胞培養 初代組織塊培養： 取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝臟剪成1mm3 左右的小塊，採用帖壁培養法。 初代消化法培養： 1.把肝組織切成2～4 立方毫米的小塊，用不含鈣鎂的BSS 液洗兩次。 2.移入1：1 的0.1%胰蛋白酶和0.1%膠原酶(都用無鈣鎂BSS 配置)中，4℃冷消化10～12 小時後，通過250 微米和64 微米尼龍網或不銹鋼紗網濾過。 3.收集細胞、BSS 液洗1～2 次、計數、接種培養。 消化培養肝細胞的另一種方法是灌流法(肝臟灌流需用全肝，以較小動物如小鼠和大鼠為好)： 1.無菌解剖動物，取出肝臟，先用BSS 洗除血污。 2.取5ml 注射器一支，吸取消化液後，把注射器頭輕輕插入肝管中，用線繩結扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入肝管系統，並不時輕揉壓肝臟，以便消化液進入肝小葉中;消化液在漏銷肝內停留20～30 分後，在吸出消化液的同時並輕揉壓肝臟，以使肝細胞脫落和消化液吸出。 3.待吸凈消化液後，注入離心管中，低速離心分離，用RPMI 1640 培養基培養(較其它培養基為好)，能獲得較純的肝上皮細胞和獲較好的效果。 傳代培養： 待細胞生長連接成片後，用BSS 洗一二次，加1：1 的0.025%胰蛋白酶和0.02% EDTA 混合消化3～5 分鍾，待細胞回縮，便停止消化，棄掉消化液，用BSS洗一二次，注入營養液，吹打，製成細胞懸液，再接種培養。 5)內皮細胞培養 1.取產後的新鮮臍帶。如不立即培養可以保存於4℃中，但不宜超過12 小時。無菌剪取長10～15 厘米一段。其它如胚胎和幼體動物的大血管，亦可用於培養。 2.先用三通注射器吸溫PBS 液注入臍帶的靜脈中，洗除殘血，注入口處宜用線繩結扎，以防液體返流。 3.用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為0.1%的膠原酶，待末端出現液體後結扎之，令充滿血管，注入口亦應結扎，以防液體返流，消化3～10 分鍾。 4.吸出含有內皮細胞的消化液，注入離心管中，為獲取更多細胞，可再注入溫PBS 沖洗2～3 次徹底清除干凈殘余細胞，一並注入離心管中離心。 5.吸除上清，加1640 培養液，製成細胞懸液，接種入瓶皿中培養，順利時2～3 天內細胞即可長成單層。 6)毛細血管內皮細胞培養 腫瘤條件培養基制備： 1.取C3H 小鼠的S-180 實體肉瘤組織。 2.胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良Eagle 氏培養液15ml(含10%小牛血清)，接種到T-75 Falcon 產培養瓶中培養。 3.在細胞生長接近完全匯合時，收集培養液製成條件培養基;再用含10%小牛血清的新培養液後，也每隔兩天收集一次，可獲得多量條件培養基。 4.4000 轉/分離心後，再通過0.22μm 微孔濾膜濾過，-20℃凍存備用(臨用前融解)。 初代培養： 1.取材：取新鮮牛腎上腺數個，先用Hanks 液洗除血污。 2.剝除被膜，分離出皮質，切成1 立方毫米小塊，加0.5%膠原酶室溫中消化1 小時，每隔10 分鍾用吸管吹打懸液令消化充分。 3.通過不銹鋼紗網濾過，網眼要求只允許能通過小於110 微米長的毛細血管小段。 4.650rpm，4℃，離心7 分鍾後，棄掉上清膠原酶。 5.沉澱物用培養液重懸並離心，再重懸，再離心，共兩次。 6.末次沉澱物仍用含有10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle 氏培養液重懸後，稍吹打。 7.接種於鋪有明膠底層的培養皿中，37℃培養，在培養頭1～3 小時中，毛細血管小段和內皮細胞最先帖附於底物上，而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養液中漂浮。 8.趁此時，吸除培養液，再加入腫瘤條件培養液，每兩天換液一次。毛細血管小段一般成自1～4 個內皮細胞，以後每個小段在底物上慢慢展成特殊形態的細胞島，能持續2～5 天。 毛細血管內皮細胞分離培養： 1.初代培養2～3 天後，鏡下確認幾個毛細血管內皮細胞島，在培養皿背面，用不脫色筆劃圈圈起。 2.鏡下檢查，如圈內殘有非內皮細胞時，可用顯微細針在倒置顯微鏡下挑除。此操作用細胞解剖器或用手操作均可，宜在凈化台無菌氣流中、打開培養皿蓋進行，但時間不宜過長(15～20 分鍾)，圈內非內皮細胞可用無菌膠刮除。 3.用培養液漂洗兩次，以去除漂浮細胞。 4.剩餘內皮細胞島如小(5～20 個細胞)而少時，生長增值變得緩慢或不完全不生長，此時需加入3T3 等飼細胞，飼細胞接種量為4000 細胞/cm2。 5.當內皮細胞充滿所有飼細胞空間後，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養基。 6.接種入明膠底物皿中繼續培養(飼細胞死亡淘汰)，細胞增殖生長匯合後，按1：5 傳代。 樓主以後想要查找這方面的信息，可以到生物幫那裡，我那裡的信息挺全面的，信息內容豐富、科學、專業。有空個可以去 www.bio1000.com/zt/cell/201378.html 那裡看下，會有幫助的。

Ⅶ 原代細胞是如何培養的選擇組織塊還是消化液培養法

原代培養即直接從有機體取下細胞、組織或器官，讓它們在體外維持與生長。原代培養的特點是細胞或組織剛離開機體，它們的生物性狀尚未發生很大的改變，在一定程度上可反映它們在體內的狀態，表現出來源組織或細胞的特性， 因此用於葯物實驗，尤其是葯物對細胞活動、結構、代謝、有無毒性或殺傷作用等，是極好的工具。

那麼，原代細胞是如何培養的呢？

常用的原代培養法有組織塊培養法和消化培養法。

（一）組織塊培養法

許多實驗室喜歡用組織塊培養法進行原代培養，因為方法簡單，細胞也較容易生長。尤其是培養心肌，有時還可觀察到心肌組織塊搏動。細胞從組織塊邊緣向外長出並鋪滿培養皿或培養瓶後， 即可進行傳代。

1. 設備材料

培養箱、冰箱、超凈工作台／無菌間、無菌吸管、離心管、酒精燈、試管架、培養瓶、培養皿、消化液、基礎培養液、胎牛血清、Hanks 溶液、雙抗試液、剪刀、攝子、小燒杯。

2. 操作步驟

（1） 在無菌條件下，取待培養的組織適量，置入小燒杯中， 以適量Hanks 溶液清洗2~3 次，去掉組織塊表面的血污。

（2）用眼科剪將組織塊反復剪成0.5~ 1mm3的小塊。

（祥鏈3）再用Hanks 溶液反復漂洗， 直至液體不混濁為止。等組織塊下沉，將燒杯傾斜，用小吸管盡量吸除Hanks 溶液。

（4）用含20%滅活血清及雙抗溶液(200U/ml 青黴素、200μg/ml 鏈黴素）的培養液再清洗，用吸管吸干後加入5ml 含20％血清的培養液。

（5）用彎頭吸管吸取組織小塊，均勻地置於培養皿內表面，吸去多餘的培養液，各組織小塊之間相距0.5cm 為宜。蓋好培養皿蓋，做好標記， 置37°C 的CO2培養箱內。

（6） 2~4h 後，於超凈工作台中，緩緩地向培養皿中加入上述含20％血清及雙抗溶液( 100U/ml 青黴素及100μg/ml 鏈黴素）的培養液少量，以使組織塊浸沒在培養液中。

（7）輕輕地將培養皿及組織塊移至CO2培養箱， 如無特殊情況，不必觀察。1~2 周後，可觀察到細胞從組織塊邊緣長出，形成生長暈。

（9） 一般說來，若培養液無明顯改變， 1 周換液1 次即可。待細胞長滿整個培養皿內表面，即可進行傳代培養。

3. 需要說明及注意的問題

（1） 如果是用培養瓶而不是培養皿，則接種組織塊千培養瓶底壁後， 要輕輕地翻轉培養瓶，令瓶底在上，蓋好瓶蓋後輕輕置入37°C 的CO2培養箱， 2~4h 後，取出培養瓶，在超凈工作台內打開瓶蓋，仍令組織塊在上方。在組織塊對面瓶壁加入適量上述培養液。然後，輕輕翻轉培養瓶，讓組織塊浸沒於培養液中。蓋好瓶蓋後放回二氧化碳孵箱，繼續培養。

（2） 從培養皿表面游離下來的組織塊，棄去即可。

（3） 如果使用玻璃培養瓶，而不是新的塑料培養瓶，則最好在玻璃底表麵包被大鼠鼠陵基尾膠原，這樣不但有利於組織塊的黏附，而且可使細胞生長得更好。

（4）本方法適於各種組織的培養，操作者還可根據自己的實驗需要和細胞種類加以修改。

（二）消化培養法

它與上述組織塊培養法的主要區別有2 點。一要用酶制劑（最常用的是胰蛋白酶）處理組織塊，除去細胞間質，使細胞相互分離，形成細胞懸液；二細胞生長方式多為單層( monolayer ) 。本方法的優點在於單層細胞更易攝取營養、排出代謝產物，因此生長較快，可較快地應用於實驗研究 ； 缺點是步驟頗尺宴謹為繁瑣，操作不慎易污染 。此外，消化處理要恰到好處，不然對細胞會有一定的損傷作用。

1. 操作程序

（1） 在無菌條件下， 取待培養的組織1cm3左右，置入平皿或燒杯中，以適量Hanks 溶液消洗3 次，去掉組織塊表面的血污及結締組織。

（2）以鋒利的眼科剪將組織塊反復剪碎，得到約0.5mm x 1mm 大小的小塊。

（3）以Hanks 溶液沖洗數遍，稍候組織塊下沉，吸除Hanks 溶液。

（4）用少量Hanks 溶液，將組織小塊吸入預先置有無菌的磁力攪拌子的錐形燒杯中，再加入15~30ml 上述胰蛋白酶消化液。

（5）將錐形燒杯用橡皮塞蓋緊，外封以錫箔。然後移至預先置入37°C 培養箱內的電磁攪拌器上。

（6）打開攪拌器的電源開關，使攪拌子旋轉， 關好培養箱，讓胰蛋白酶進行消化。

（7）在消化過程中，每隔一定時間吸取消化物滴於載片上，於光學顯微鏡下觀察，檢查細胞是否分散成單個。若大部分細胞已分散，立即加入適量Hanks 溶液，終止消化。通常需消化10~20min 。

（8）先以100μm 不銹鋼篩過濾，濾去未消化的組織塊或大細胞團（如獲得的細胞量少，這些組織塊可繼續進行消化，以便取得較多細胞）。繼以20μ 不銹鋼篩過濾。

（9）將取得的濾液進行低速（每分鍾500~ 1000 轉）離心5min，吸除上清液。並用Hanks 溶液離心清洗1~2 次，最後加入含血清的培養液，攪勻，製成細胞懸液。

（10）用計數板計數，確定細胞懸液濃度，通常以1×105~3×105個接種於培養瓶或培養皿中。

2. 需要說明及注意的問題

（1） 用何種酶進行消化可視所培養細胞而定，除胰蛋白酶外，常用1 型膠原酶消化睾丸支持細胞、血管平滑肌細胞和內皮細胞；用II 型膠原酶消化大鼠腺垂體細胞等。

（2）如果沒有不銹鋼篩， 可用4 層紗布代替，但紗布要預先經高溫高壓滅菌。

（3） 嚴格地說，原代培養是指未經傳代的細胞，但在實際工作中，人們常將10 代以內的細胞用作原代培養細胞，因為此時的細胞基本上保持著原有的生物學特性。

（4） 從原代培養的操作步驟不難看出，原代細胞中含有多種細胞成分，即它們是異質型( heterogeneity) 的群體，因此在設計實驗及分析結果時，切勿忘記這一因素。

Ⅷ 如何配置膠原酶2u/ml的膠原酶溶液，需要多少毫克膠原酶

梯度的配置一般高往低逐步稀釋，一般現配一個大濃度的儲備液你可以配1g/ml的，方法是稱取100g的樣品溶解後用100ml的容量瓶定容
50mg/ml的配置：量取5ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
40mg/ml：量取4ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
30mg/ml：量取3ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
,20mg/ml：量取2ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
10mg/ml：量取1ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
望採納，謝謝

Ⅸ 注射用膠原酶的用法用量

臨用前，用氯化鈉注射液2ml溶解。椎間孔內硬膜外或椎間盤內注射一次1200單位。注射方法：患者側卧。從脊柱後側旁進針，在X光電視屏幕透視下，針沿腰椎橫突插入L4-L5或L5-S1的椎間孔內硬膜外或椎間盤內注射。

Ⅹ 哪位做過脂肪細胞原代培養

方案 23.12 脂肪細胞的原代培養

實驗材料

DMEM-ADMEM-B膠原蛋白酶雄性 Sprague-Dawley 大鼠

試劑、試劑盒

KRBH緩沖液KRBH-A緩沖液

儀器、耗材

Petri培養皿錐形離心管聚丙烯管低密度聚丙烯瓶尼龍濾網尖解剖剪Perry鑷塑料箱鍘刀移液器

實驗步驟

一、切除附睾脂肪墊

1. 在充有 70 % CO2和 30 % O2混合氣體的塑料箱內麻醉大鼠（雄性 Sprague-Dawley 大鼠：145~170 g，CD 系（Charles River Breeding Laboratories）。

2. 用鍘刀斷頭放血。

3. 將鼠體在 70 % 乙醇內浸泡一會兒。

4. 盡量在無菌條件下切除附睾脂肪墊。

(a)用一把解剖剪剖開下腹部皮膚，暴露腹膜。

(b)用另一把解剖剪剖開腹膜，然後用 Perry 鑷向上牽拉睾丸。

(c)剪取附睾脂肪墊，注意保留血管。

5. 將組織移送到培養實驗室。

脂肪細胞的膠原蛋白酶（在 2 ml KRBH 緩沖液加入 20 mg/ml 膠原蛋白酶，然後用 0.22 μm 濾器過濾）消化和洗滌

6. 將 4 g 脂肪墊（相當於 8 個附睾的脂肪墊）放入盛有 4 ml KRBH 緩沖液 （Krebs-Ringer 液，pH 7.4，添加 10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES（Sigma）、200 nmol/L 腺苷（Boche）和 1 % BSA （W / V，Intergen）。配製 1 L KRBH 緩沖液時，用 7 g NaCl、0.55 g KH2PO4、0.25 g MgSO47H2O、0.84 g NaHCO3、0.11 g CaCl2、7.15 g HEPES、10 g BSA、1 ml 200 μmol/L 腺苷， 加超凈水至 1 L。然後，按 100 ml 分裝。使用前加熱至 37°C，並將 pH 調整至 7.4。）（37°C）的 30 ml 低密度聚丙烯瓶內。

7. 將脂肪墊剪成直徑約為 2 mm 的組織塊。

8. 將組織塊放入瓶內，然後加入 1 ml 膠原蛋白酶液。在 37°C 水浴振盪器孵育約 1 h，直至細胞混合物形成乳脂樣濃稠液體。

9. 膠原蛋白酶消化後，向瓶內加入 4 ml KRBH 緩沖液（37°C）。

10. 通過攪拌混勻瓶內的細胞，然後用孔徑為 250 μm 的尼龍濾網（孔徑為 250 μm，放入支持物或漏斗內）將細胞輕輕濾入 50 ml 錐形離心管。

11. 通過向離心管內加入 30 ml KRBH 緩沖液（37°C）洗細胞。用台式離心機短時間離心（ 200 g），然後用吸管吸出下清液。注意脂肪細胞浮在水性緩沖液的上面。

12. 通過加入 40 ml KRBH 緩沖液洗細胞，離心，除去下清液。重復該步驟 1 次。

13. 用 40 ml DMEM-A （DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨醯胺、200 nmol/L（R )-N6-（l-methyl-2-phenylethyl）腺苷（PIA，Sigma）、100 μg/ml 慶大黴素和 25 mmol/L HEPES。按 100 ml 分裝，使用前加熱至 37°C）（37°C）洗細胞 2 次。

14. 用約 40 % cytocrit DMEM-A 混懸漂浮的細胞。

二、脂肪細胞的原代培養

15. 用 200 μl 大口徑吸頭將 2 ml 40 % cytocrit DMEM-A 懸液移入 60 mm 培養皿。

16. 將培養皿放入濕潤的培養箱，在 37°C 和 5 % CO2的條件下培養 1.5 h 。

17. 向培養皿內加入 5 ml DMEM-B（DMEM-A，添加 7% BSA）。

此時，應進行葡萄糖攝取實驗 [ Quom 1998 ]，檢査細胞的活力。

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中山醫科大學學報(AcadJSUMS),2001,22(6):443~446443

人前脂肪細胞的原代培養

王竹晨1,劉建中2,李??燕2,楊冬梓1,鄺健全1

(中山醫科大學??1.孫逸仙紀念醫院婦產科,2.生物教研室,廣東廣州??510120)

摘??要:??目的 建立人前脂肪細胞原代培養方法,以更深入地研究人體脂肪組織增生的生物學特徵。??方法 選用成人的腹部脂肪組織,採用原代消化細胞培養法培養出棱形細胞;同時取皮膚組織,進行成纖維細胞培養作為對照。??結果 培養出的棱形細胞成分均一,增殖旺盛,分化率高。經形態學動態變化的觀察,生長曲線及油紅O脂肪染色抽取法測定,證明是功能活躍的前脂肪細胞,並在體外重現了其增殖的全過程。??結論 在成熟的脂肪組織中存在著可分化成熟、生成脂肪的前脂肪細胞。由於脂肪細胞是胰島素作用的經典靶細胞之一,本實驗為進一步研究與肥胖及胰島素抵抗相關的疾病如多囊卵巢綜合症等打下了基礎。

關鍵詞:前脂肪細胞;細胞培養;脂肪組織

中圖分類號:Q254,R711.75??????文獻標識碼:A??????文章編號:1000-257X(2001)06-0443-04

WANGZhu??chen1,LIUJian??zhong2,LIYan2,YANGDong??zi1,KUANGJian??quan1

(1.,SunYat??senMemorialHospital,2.DepartmentofBiology,

SunYat??,Guangzhou510120,China)

Abstract:??Objective .??Methods Usingprimarycellculture,fibroblast??..??Results Thecellswerehighlyhomogeneous,.,growthcurve,,.Undercontrolledconditions,.??Conclusion Inmaturehumanadiposetissue,.,thisstudylaidthebasisforfur??syndrome.

Keywords:preadipocyte;cellculture;adiposetissue

????脂肪細胞是胰島素作用的經典靶細胞之一,與

肥胖及胰島素抵抗相關疾患如多囊卵巢綜合症的

研究關系密切,近年來受到婦科內分泌領域的重

視。前脂肪細胞是一類具有增殖和向脂肪細胞分

化能力的特異化的前體細胞,它的存在和作用持續

於人的一生,我們從人脂肪組織中培養出了前脂肪

細胞,為進一步研究打下了基礎。

????收稿日期:2001-04-23

????基金項目:廣東省衛生廳科研基金資助課題(2001189)

????,;1??材料與方法1.1??組織來源選取2000年9月~2001年1月本院婦科內分泌病房行輸卵管復通術的正常體重患者。年齡20~40歲,身體健康,無其他急慢性疾病。術中開腹時切取皮下脂肪組織及皮膚組織。

444

1.2??試驗材料

1.2.1??主要試驗用品和化學試劑??DMEM/F??12培養基(1!1),無支原體胎牛血清,?型膠原酶,Hepes,人轉鐵蛋白,青、鏈黴素原液均購自GIBCO公司;生物素、泛酸鹽、氫化可的松,三碘甲狀腺原胺酸(T3),3??異丁基??1??甲基黃嘌呤均系SIGMA公司產品。牛血清白蛋白購自Roche公司。試驗所需無機試劑購自廣州市醫葯公司化試批發部,均系分析純試劑。培養瓶購自KORNING公司。

1.2.2??培養基及主要試劑的配製??培養基A[1]中山醫科大學學報(AcadJSUMS),2001,22(6)培養基A製成細胞懸液,接種至25cm2培養瓶內,密度為每平方厘米3?10個細胞,置37#,體積分數5%CO2培養箱內孵育16h後,PBS輕輕洗去培養瓶內未粘附的物質,換用培養基C誘導和維持脂肪細胞分化,3d後更換為培養基B,以後每2~3d更換一次培養基B。1.3.2??人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞的組織學染色??蓋玻片剪成0??5cm?1??0cm大小,接種時置入培養瓶內,待細胞貼壁後每2、3d從培養瓶內取出染色。將貼有脂肪細胞的面朝上,浸入體積分

數為10%甲醛的等滲鹽緩沖液中固定10min,然後放入PBS緩沖液中,輕輕漂洗片刻,直立使殘留水份流到邊緣,吸水紙吸掉。稍乾燥後,人前脂肪細胞採用蘇丹%??&滴染法及Mayer蘇木素復染細胞核,甘油明膠封片;皮膚成纖維細胞採用常規蘇木素-伊紅染色,脫水透明後中性樹脂封片,光鏡觀察並拍照保留結果。

1.3.3??細胞生長曲線的繪制??將細胞懸液等量接種至24個培養瓶內,隨機分成8組,每組3瓶,每2d檢測一組中每個瓶中的細胞總數,取3個瓶的均值,如此至第8組結束。細胞計數方法參照醫學細胞生物學實驗[3]。

1.3.4??油紅O染色提取法測定細胞內的脂肪含量??接種方法同1.3.3,根據Ramirez[2]4:按說明取DMEM/F??12培養粉5g,加入胎牛血清使其體積分數為10%,三蒸水定容至500mL;培養基B:按說明取DMEM/F??12培養粉10g,加入終濃度分別為15mmol/LNaHCO3,15mmol/LHep??es,33??mol/L泛酸鹽,17??mol/L人轉鐵蛋白,100000U/L青黴素,0??1g/L鏈黴素,100nmol/L氫化可的松,60nmol/L胰島素,0??2nmol/LT3,三蒸水定容至1000mL;培養基C:取培養基A200mL,加入3??異丁基??1??甲基黃嘌呤,使其終濃度為0??25mmol/L;消化液:稱取膠原酶(?型)150mg,牛血清白蛋白2g,0??01mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)定容至100mL;紅細胞溶解緩沖液:稱取適量NH4Cl,K2HPO4和EDTA,使其終濃度分別為154mmol/L,5??7mmol/L,和0??1mmol/L,三蒸水

定容至250mL。上述溶液均經調整pH值至7??4~7??6,0??22??m微孔濾膜正壓過濾除菌,分裝後置-30#保存。油紅O工作液[2]等的方法測定。培養物用體積分數10%甲醛的等滲鹽緩沖液固定1h後,蒸餾水漂洗。吸取油紅O工作液10mL,使培養面向下浸染,2h後倒掉瓶內的油紅O

工作液,蒸餾水漂洗培養瓶數次,直至完全漂浮干凈。將已染色的培養瓶置於32#孵箱內蒸發掉瓶內的水份後即加入1mL異丙醇,萃取出的染液即刻用吸管移出,於HITACHIG2000型分光光度計510nm波長處測吸光度。:稱取4??2g油紅O溶於1200mL異丙醇中室溫靜置過夜,分析濾紙過濾後收集濾液,並加入900mL三蒸水,於4#再次靜置過夜後過濾兩次即可於室溫貯存備用。1.2.3??儀??器??CO2培養箱,倒置顯微鏡等。1.3??方??法

1.3.1??人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞的原代培養[1]??術中切取脂肪組織約60g,同時切取皮膚組織約0??5cm?3cm進行成纖維細胞培養作為對照。PBS洗滌,分離去除脂肪組織中肉眼可見的纖維成份及血管,皮膚組織則需去除表皮和皮下脂肪,剪碎成約2mm?2mm的小塊,加入消化液,置37#,體積分數5%CO2培養箱內消化。15h後,200?g短時離心,去除漂浮的脂肪細胞及培養液,沉積的細胞用紅細胞溶解緩沖液再次配成細胞懸液,37#孵育10min,以去除污染的紅細胞,150??2??結??果2.1??原代培養的人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞形態學觀察細胞貼壁後初為小圓形,核/漿比例較大(圖1??1),4d即可觀察到細胞漸成梭型,7d左右此棱形細胞大量繁殖,面積達到培養瓶底1/2之後開始積聚脂肪顆粒(圖1??2)。9d可觀察到細胞由棱形漸變成橢圓形或圓形(圖1??3),積聚有脂肪顆粒的

第6期??王竹晨,等.人前脂肪細胞的原代培養445肪細胞(圖1??4)。體外培養的脂肪細胞體積較大,細胞膜較薄,膜輪廓不光滑,凹凸不平有皺折,胞質內有大量圓形脂滴,大小不等且多散在,也有小脂滴大量觸合成大脂滴的情況,核仍位於邊緣,而同時培養的皮膚成纖維細胞增殖速率相似,但始終為長棱形,無脂滴積聚(圖2??1,圖2??2)。

2.2??人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞的生長曲線

由生長曲線可見人前脂肪細胞(圖3??1)和皮膚成纖維細胞(圖3??2)的倍增時間分別為60h和55h

。3??討??論3.1??人前脂肪細胞培養在婦科內分泌領域的研究意義脂肪細胞是脂肪組織的重要組成部份,也是其發揮功能的主體。當代研究認為脂肪組織中脂肪細胞非常活躍,細胞的數目,形態及細胞內脂肪的含量均處於動態變化之中,並保持終生。肥胖症被認為是脂肪細胞增殖和分化失控的結果。目前,肥

胖已成為與婦科內分泌領域密切相關的疾病,肥胖可產生胰島素抵抗/高胰島素血症,而胰島素抵抗/高胰島素血症是許多臨床疾病或病症,尤其是常見的內分泌代謝性疾病如糖尿病、高血壓和動脈粥樣硬化等的共同危險信號,因此成為近年醫學多學科共同感興趣的研究熱點。特別是近年的研究發現

圖3.1??人前脂肪細胞生長曲線

Fig.3.1??

culture胰島素抵抗/高胰島素血症還與育齡婦女高雄激素血症及無排卵有關。臨床常見的多囊卵巢綜合症,

生育年齡婦女中約有5%~10%患者此症,常伴有肥胖,病因不明。目前認為多囊卵巢綜合症即是以胰島素抵抗為特徵的內分泌代謝性疾患,繼發於胰島素抵抗的高胰島素血症對造成高雄激素徵象起著重要作用,並致不孕[4]。脂肪細胞作為對胰島素

圖3.2??人皮膚成纖維細胞生長曲線

Fig.3.2??敏感的靶細胞之一,因此對其潛在胰島素抵抗機制的研究具有特殊臨床意義。體外前脂肪細胞培養

能完整地認識脂肪組織的發生和增生的全過程,並且可以直接觀察各種因素對這個過程的調控,研究其機制,是研究脂肪組織的理想模型。國外雖已建立了來源於鼠的前脂肪細胞的細胞株如3T3??L1、3T3??F442A,ob17系列等,但到目前為止,尚未見有人的前脂肪細胞株建立[5],因而使進一步的研究受到了限制。

3.2??體外培養的人前脂肪細胞的生物學特性

目前國內外前脂肪細胞體外培養系統大致有兩類,一類來源於血管基質組份細胞(stromalvas??cularfraction,SVF),這是經典的前脂肪細胞。Van等[6]對SVF的系統研究形成了完整的前脂肪細胞理論。他們將切下的脂肪組織用膠原酶處理,再將組織懸液離心,其中的沉澱物基質血管成份即是SVF,將其SVF進行培養,和培養的成纖維細胞比較,這兩種培養物以差不多的速率增殖,倍增時間約55h左右。在顯微鏡下比較細胞,發現起初2.3??前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞生長過程中細胞內脂肪含量的變化前脂肪細胞內的脂肪含量於培養9d後迅速增加,16d左右到達高峰,而皮膚成纖維細胞內僅有極少的脂肪積聚(圖4)

。圖4??前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞生長過程中細胞內脂肪含量的變化Fig.4??lture

446

可積聚大量脂滴,而成纖維細胞的胞漿內則無或只有少量的脂滴。這就證明了SVF是具有增殖和向脂肪細胞分化潛能的前脂肪細胞。本實驗研究結果與之相符,符合文獻中提出的3個標准[6]。此外,近年還有人報道採用脂肪組織塊貼壁和天花板培養相結合的方法也獲得了成功[7]。此種方法得到的前脂肪細胞與SVF不同,可能來源於Carraro等發現的成熟脂肪細胞內都有的一種細胞島[8]。但此種方法是採用有血清培養並且與成熟脂肪細胞共同孵育,不適於作為成熟脂肪細胞所分泌的某些細胞因子的體外研究模型。

前脂肪細胞的培養闡明了其增殖和分化的關系,目前認為這是一種生長停頓?生長再續?細胞分化的連續關系。生長停頓是必要的第一步,此後這些細胞至少進行一次以上的再分裂,才繼續向成熟脂肪細胞轉化。並隨時間的推移出現甘油??3??磷酸脫氫酶(GPDH)mRNA這個晚期標志物,這也是脂肪合成所必需的限速酶,並最終變成脂肪細胞。我們的研究也觀察到細胞貼壁後經過一段時間的潛伏期後開始生長,3、5d左右大量增殖,1周後開始有脂肪顆粒的積聚。培養2周時,分化成多脂滴或單脂滴的脂肪細胞,與文獻報道一致。

油紅O染色提取法可簡便、快速地對體外培養的前脂肪細胞轉化率進行定量。文獻報道其准確性和敏感性與測定前脂肪細胞分化過程中的標志酶GPDH相似[2]。因此常用來作為對體外培養的前脂肪細胞進行鑒定。體外培養的前脂肪細胞在胰島素、氫化可的松等的作用下,GPDH即開始上升並迅速增加,8d左右達到高峰並維持在高水平[2]。我們採用油紅O染色提取法進行研究,結果表明,前脂肪細胞在培養第3天即開始有脂肪的積聚,1周後積聚量明顯增多,2周時達到高峰,與形態學上的培養1周後細胞內開始出現脂肪顆粒相吻合。並說明酶的出現在先,脂肪出現在後,細胞內脂肪含量的明顯增加比GPDH的出現要晚1周左右,與文獻報道相吻合[2]。

3.3??人前脂肪細胞培養技術的特點

脂肪組織來源於原始的網狀結締組織,由結締組織和脂肪細胞組成,細胞成分中以脂肪細胞為主,此外還含有網狀細胞,間充質細胞,組織細胞,內皮細胞等。脂肪細胞和成纖維細胞均來自中胚層,因此培養脂肪細胞和培養成纖維細胞具有相似[9]中山醫科大學學報(AcadJSUMS),2001,22(6)外培養條件有差異[10],不同的是需要促脂肪形成因子的作用,目前已知的這類物質有:胰島素、糖皮質激素、甲狀腺素、生長激素、轉鐵蛋白,3??異丁基??1??甲基黃嘌呤,纖維粘連素等。培養基一般採用DMEM和F12按1!1比例配製,細胞數量適中,初次接種時細胞貼壁不十分牢固,動作要輕柔以免細胞漂浮。選用的取材對象越年輕越容易生長。人類一般選用外科手術切取腹部脂肪組織,如用注射器抽吸則易損傷細胞,降低成活率。(本文圖1,2見插頁2)參考文獻:[1]HaunerH,PetruschkeTH,RussM,etal.(TNF??)??[J].Dibetologia,1995,38(7):764.[2]Ramirez??ZacariasJL,Castro??MunozledoF,kuri??Har??cuchW.??[J].Histochemistry,1992,97(6):493.[3]趙??剛,劉建中.醫學細胞生物學實驗與習題[M].北京:科學出版社,1999.35.[4]DunaifA.??drome[J].Endocrinol&MetabClinNorAm,1999,28(2):341.[5]BillingsE,MayJW.Historicalreviewandpresentsta????constructivesurgery[J].PlastReconstrSurg,1989,83(2):368.[6]VanRLR,BaylissCE,RoncariDAK.rsinculture[J].JClinInvest,1976,58(9):699.[7]朱曉海,何清濂,林子豪.人前脂肪細胞培養及增殖與分化模型的建立[J].中華整型燒傷外科雜志,1999,15(3):199.[8]CarraroR,LiZH,JohnsonJE.ntratadipocytes[J].CellTissRes,1991,264(2):243.[9]劉??清,鄧漪平.內皮-平滑肌聯合培養:細胞間相互作用對組織型纖溶酶原激活劑的影響[J].中山醫科大學學報,1992,13(4):18.[10]朱永源,利天增,蘇愛雲,等.人表皮細胞的體外培養[J].中山醫科大學學報,1998,19增刊:34.(??,)