膠原酶沒過濾怎麼辦

⑴ 請教大鼠原代肝細胞的分離和培養的問題

我記得好像有這一方面的的論文，題目都一樣的《大鼠原代肝細胞的分離與培養》是徐麗娜 鞠雷 顧憲銳 張恆 馬玉忠 河北農業大學動物科技學院的
http://www.cqvip.com/qk/96216X/200712/26163977.html
你下載來看就行了（不過下載要錢）

下面我給你，我做的一個過程（僅做參考）
我做的就是大鼠原代肝細胞，養了一段時間了，下面是我的實驗步驟，希望對你有所幫助。
1）3-5天乳鼠，斷頭處死，75%酒精浸泡3-5分鍾。
2）移入超凈台內，無菌取下肝臟，放入冷PBS內，撕下被膜等。
3）移入25ml燒杯內，剪成1mm3左右大小，PBS清洗至上清無色。
4）移入三角瓶內，加5倍量0.05%胰酶37度消化20分鍾。
5）終止消化，靜置，棄上清。加0.05%膠原酶消化20分鍾。
6）100目過濾。離心，800，3分鍾。
7）計數，調整濃度，接種。24小時第一次換液，以後沒兩天換一次液，4、5天可以鋪滿。

二、方法

1．傳統門靜脈灌流消化法（傳統門脈灌流法）：參照鄒氏等文獻方法[3,4,5]。

2．低濃度膠原酶原位循環灌流法：

2.1取Wistar大鼠，用2%戊巴比妥鈉10mg/100g體重、肝素20 u/100g體重分別腹腔注射以麻醉和抗凝。

2.2 10-15分鍾後固定大鼠，75%酒精消毒，紫外燈照射15-30分鍾。腹部再次75%酒精消毒後正中切開打開腹腔並更換器械。

2.3顯露肝門部門靜脈並游離2-3cm；顯露游離肝下下腔靜脈2-3cm，各置一結扎線，暫不結扎。

2.4穿刺針插入門靜脈後立即結扎固定，盡快接通硅膠管並啟動蠕動泵（無泵時，輸液器亦可），同時剪斷肝下下腔靜脈遠端。

2.5用D-Hanks液20-30ml/min快速灌注清除肝內血液，1分鍾內即可見肝臟顏色變淺，持續灌注10分鍾至肝臟呈米黃色。同時切開胸腔結扎肝上下腔靜脈。

2.6插另一硅膠管入肝下下腔靜脈並結扎固定，換D-Hanks液為膠原酶消化液(370C預熱)循環灌注消化，灌流速度為10-20ml/min，持續時間10-20分鍾至肝質變軟，壓之凹陷不易恢復。

2.7停止灌注，小心剪取各肝葉置入消毒平皿內，加入適量肝細胞洗滌液（4oC預冷），撕碎肝臟並祛除纖維結締組織，製成混合肝臟細胞懸液。

2.8 100目篩網過濾入50ml離心管，500rpm離心1-2分鍾。去上清，沉澱加入RPMI 1640 （4oC預冷）20-30ml洗滌3次。

2.9肝細胞沉澱加入肝細胞培養液重懸為10ml，取適量計數並用0.4%台盼藍染色判斷存活率。後即可按實驗設計接種培養

我們目前正在做大鼠肝臟細胞的分離培養（原位循環灌注法），我把大體步驟和大家交流一下。
1，動物稱重，戊巴比妥麻醉。
2，固定，消毒，腹部正中十字切口，或者「U」型切口進腹。
3，分離門靜脈和肝下下腔靜脈，分別插管，從門靜脈注入肝素，使大鼠全身肝素化。
4，阻斷肝上下腔靜脈（位置較深，分離結扎有難度，可用哈巴狗血管夾夾住，亦可用消毒棉簽壓迫）
5，從門靜脈內注入D-HANKS，直至肝下下腔靜脈插管內流出來的液體中不含或含少量紅細胞，肝臟呈米黃色。
6，此時接上自製的膠原酶循環灌注裝置（循環通路：門--肝--肝下下腔--蠕動泵--門），灌注15分鍾左右，到肝臟表面呈顆粒狀為止。
7，取下肝臟，剪碎，去結締組織，放入含有膠原酶的三角瓶中繼續水浴消化10分鍾後加入HANKS 或者1640終止消化。
8，將3角瓶帶入超凈台內，在超凈台內完成以下步驟。
9，50目篩網，200目篩網，1640兩次吹打過濾。獲得細胞懸液。
10，1640洗滌離心3次，收集細胞，製成一定濃度的懸液。
11，計數，調整濃度，培養。

（大體步驟，太多細節不贅述，我們曾用此方法分離乳豬，大鼠的肝細胞，結果令人滿意）

注意點：
1，腹部切口位置要合適，避免誤入胸腔導致大鼠死亡。
2，插管要固定，避免滑脫。
3，阻斷肝上下腔可以用小哈巴狗，但我們實際發現用下毒棉簽壓迫更為簡單，效果也令人滿意。
4，所有灌流液均要預熱。
5，肝臟消化完畢後，立即拿到超凈台內操作，注意無菌觀念。
6，消化時間8宜過長。
7，組織塊比較大，通過50目篩網有困難時，可用消毒注射器活塞輕輕擠壓組織塊，勿研磨！

優點：
1，消化充分，且節約膠原酶。膠原酶比較昂貴 ：）
2，在肝臟離體之前大鼠保持呼吸心跳，從而最大限度的保持了細胞的活力。
缺點：
需要一定的手術技巧，了解肝臟循環結構，且血管插管有一定難度。

⑵ 誰知道0.2%Ⅱ型膠原酶和10%胎牛血清的怎麼配製

每 100mg 膠原酶加入 50ml 培養液中 攪拌
均勻 用 0.2 微米 微孔濾膜過濾分裝 -20 低溫冰箱保存

450mlDMEM+50mlFBS

⑶ 我頸椎盤突出,膠原酶打了已有三個月了怎麼還沒好

目前,治療此類病的方法很多,主要分三大類:一是物理療法,如傳統的牽引、推拿、按摩、火罐、針灸以及通過紅外線、微波等熱、光、電、聲的物理方法治療。二是微創療法,如用激光和膠原酶進行治療。即用激光汽化椎間盤,膠原酶軟化椎間盤,再用椎間盤內窺鏡,取掉壓迫神經的髓核,來根治此病。三是通過手術方法治療,即切除壓迫神經根的髓核。患者宜採取哪種方法治療,需根據病情,對症治療。

⑷ 鼠尾膠原蛋白I型，用那一種膠原酶可以溶解

醋酸就可以.

1．將膠原加入到0.1M 的醋酸中，制備成濃度為0.1%的溶液。在室溫中攪拌1-3小時直到完全溶解。

2．建議將溶液轉移到擰口的玻璃瓶中，並小心的在瓶底鋪上一層氯仿。氯仿的量約為膠原溶液的10%。不要晃動或攪拌。在2-8度中放置過夜。在無菌條件下轉移上層的膠原溶液。我們不建議用過濾的方法無菌化。已經發現該方法會導致丟失蛋白。

3．稀釋一定數量的膠原溶液。

4．按照6-10ug/cm2的濃度包被培養瓶。在室溫或37度結合數小時或者2-8度過夜。

5．從包被表面除去多餘的液體。過夜乾燥。如果膠原溶液不是無菌的，這時候可以在無菌細胞操作室中暴光在紫外線下過夜消毒。 在接種細胞前用無菌的水漂洗。

⑸ 腰突注射膠原酶後坐骨神經痛有所緩解，但沒徹底好，怎麼辦

建議採用中醫外敷的方法治療，因為完全無副作用，緩解或康復後也不易復發。避免了口服葯引起的胃腸不適，以及打針（封閉）對肝腎的損害。止疼類葯物（口服、針劑）副作用大，可引起骨質疏鬆症。 給您介紹一個療效顯著、見效迅速的外敷噴劑，用起來非常方便。治療腰椎病、腰椎間盤突出、坐骨神經痛等引發的各種症狀的效果非常好。尤其是止疼痛、祛寒除濕、溫經通絡的效果非常棒！！！建議您試試，初次使用疼痛就會得到非常明顯的緩解，只要在用上幾次（病情嚴重可適當增加用葯次數），病痛就可以消除了。需要說明，我可不是別人雇我當托賣假葯坑人做缺德事。只因為治療效果這么好的葯實在是難得也絕對值得一試，我患有腰椎間盤突出，而我的腰椎疼痛和大腿的酸脹麻木也是實實在在用這個葯治好的，用了大概三四次症狀就全沒有了。您考慮一下，對照自己的病症。要是覺得對病情恢復有幫助，您就可以試試。相信用後您的症狀一定也會大大緩解，並能盡早康復！用谷歌搜『力膚葉' 就能找到。

⑹ Collagenase D是否就是Collagenase IV

膠原酶的化學名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構，而不損傷其它蛋白質和組織。膠原酶的化學本質是一種蛋白質，因此，這對溫度、PH和導致蛋白質變性的各種因素均非常敏感，極易受到外界條件的影響而改變其本身的構象和性質。 膠原酶按其存在的方式不同可分為人體內源性膠原酶和葯用膠原酶兩種。人體內源性膠原酶是指人體內部本身所具有的膠原酶，如牙齦、觸膜等上皮組織和關節滑膜、椎間盤內都不同程度的存在著這種膠原酶，它在體內膠原蛋白的分解過程中發揮著不可或缺的作用。葯用膠原酶是指利用生物制葯的高科技手段從溶組織梭狀芽孢桿菌的發酵液中提取、純化並精製而得的白色或類白色無菌凍乾粉針生物制劑。 膠原酶（collagenase）是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結締組織中膠原蛋白成分。當擬消化的組織較硬，內含較多結締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細胞的效果較差，這時可採用膠原酶解離細胞法。 膠原酶僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。因此適於消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%。膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶，要根據所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。 1、膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用於哺乳動細胞的分離。 2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。 3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用於胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞。 4、膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。 膠原酶的配置 膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。 注意： 因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。 鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。 膠原酶的使用 1.將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm3左右小塊 2.將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。 3.將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內，每隔3min振搖一次，如能放在37℃的恆溫震盪水浴箱中則更好。 消化時間與組織的類別很有關系，對於某些腫瘤組織或其他較緻密結締組織，消化時間4~48h，對於容易消化的組織可以採用37℃震盪消化15~45min，也可以根據具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經膠原酶消化後，由於上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。 4.收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用100目不銹鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者無血清培養液離心漂洗1~2次，去除上清，加培養液製成細胞懸液，接種培養瓶。

⑺ 膠原酶和胰酶在細胞原代培養中的區別

膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用，作用對象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。消化原代培養的上皮類細胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應用的消化劑.胰蛋白酶是一種胰臟製品,對蛋白質有水介作用,主要作用於賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開,在常用的蛋白酶中由於產品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的作用,取決於細胞類型、酶的活力、配製的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等.

膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶,對膠原有很強的消化作用.適於消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細胞間質有較好的消化作用,對細胞本身影響不大,可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害.該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養液配製,即操作簡便又可提高細胞成活率,最終濃度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無需機械振盪,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本.

⑻ 腰間盤突出打了膠原酶三個多月了，沒啥效果

如果一點效果都沒有可以換其他方法來治療。

⑼ 膠原酶的配置

膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。
注意：
因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。
鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。

⑽ 做完膠原酶消除骨刺的手術後兩腿無力怎麼辦

沒事的小夥子，你這是質增生術後常見問題，正常現像不用擔心，有很多原因，可能坐骨神經有影響，多吃點B類維生素促進神經修復，好好休息啦，情況不見好轉建議深入就醫，別擔心會好的