wb預制膠原理是什麼

Ⅰ western的一抗有哪些都是什麼，原理又是什麼

做western時需要用到一抗和二抗，其中一抗的特異性要求很高，一抗有很多來源的，如鼠源、兔源等，現在很多生物試劑公司都有產品，選個質量有保證的比較可靠，一抗與目的蛋白（抗原）結合後連接牢固，再用TBS洗脫非特異性結合的抗體，再加二抗孵化，再洗脫，二抗一般用鹼性磷酸化酶或者辣根過氧化物酶標記，這樣待檢目的蛋白就偶聯上一抗——二抗——標記酶，最後再用發光液作為酶底物反應，在暗室中即可看見信號強弱不同的熒光，再用膠片曝光就得到了western最終結果

Ⅱ wb實驗的原理和步驟

WB實驗是通過聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）將混合蛋白質樣品分離後，利用特殊虹吸或電場裝置印跡至固相介質（例如PVDF膜）上，再以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與相對應的第一抗體特異性結合，之後再與酶或同位素標記的第二抗體相結合，最終通過底物顯色或放射自顯影來檢測特異性目的基因表達的蛋白成分。
清洗玻璃板:清洗玻璃板後風干，將玻璃板對齊後放入夾中卡緊，操作時對齊，以免漏膠。
10%分離膠的配置:混合搖勻(用移液槍抽吸混勻液體，不要將液體完全打出防止氣泡)
灌膠：沿玻璃板右上角緩慢勻速加入分離膠(用1ml移液槍，不要將移液管內液體完全打出防止氣泡)保持液面平穩上升至上方綠色線為止
水封：立即用1ml超純水進行水封(利用重力把膠壓平)，如有氣泡則用針頭吸出防止影響電泳效果，等待20-30min。
濃縮膠的配製(5%)。

Ⅲ western blot中封閉起什麼作用

轉膜後，膜上其他的空白位置需要用封閉液封閉。Western的靈敏度某種程度上受限於封閉做的好不好。

在做Western blot實驗中，會用到固相載體(如NC膜，PVDF膜)，在這些固相載體表面有很多洞洞，通過電轉，膠上的蛋白被轉移到膜上，蛋白以機械填補(堆積)和吸附的方式結合於表面。

蛋白塞進了表面的很多洞洞裡面，但是蛋白並不是連續的，而有很多空隙，抗體也是蛋白，也會被吸附在空的洞里，這樣就會有很多非特異性的信號。

(3)wb預制膠原理是什麼擴展閱讀：

封閉液中的蛋白可以與固相載體表面的空白位置結合，以機械填補(堆積)和吸附覆蓋的方式結合在膜上，填補和覆蓋蛋白結合位點以避免非特異性結合。同樣，這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠狠牢固結合在空白位置上，這樣抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上，而只會跟特異性蛋白結合。

封閉液應封閉所有的未結合位點而不替換表面上的靶蛋白，不結合靶蛋白表位，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。

轉膜後，膜上其他的空白位置需要用封閉液封閉。Western的靈敏度某種程度上受限於封閉做的好不好。

Ⅳ western blotting轉膜是根據什麼原理

原理：
western
blotting轉膜一般採用「濾紙-凝膠-膜-濾紙」夾心法，凝膠靠近負極，膜靠近正極。
因為蛋白上結合有sds，因而帶負電，在電流的作用下會從負極向正極運動，從而轉移到膜上。
希望能幫到你！

Ⅳ wb實驗的原理和步驟

WB實驗是通過聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）將混合蛋白質樣品分離後，利用特殊虹吸或電場裝置印跡至固相介質（例如PVDF膜）上，再以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原。

與相對應的第一抗體特異性結合，之後再與酶或同位素標記的第二抗體相結合，最終通過底物顯色或放射自顯影來檢測特異性目的基因表達的蛋白成分。

WB 中常見的問題以及處理辦法。

一、信號強度低

信號強度低是指在正常曝光條件下得到的目的條帶微小或是沒有目的條帶，而增加曝光時間又會招致背景高、雜帶多等問題。掃除試劑質量、操作失誤等方面的影響，這一類問題產生的主要緣由如下：

① 樣本蛋白表達量缺乏。倡議添加蛋白表達量較高的細胞系作為陽性對照，或是恰當增加上樣量以取得較高程度的信號；

② 蛋白質降解。在蛋白樣品制備期間留意蛋白酶抑止劑 PMSF 的運用，所制備的樣品盡快檢測或妥善保管；

③ 蛋白的轉膜。運用恰當孔徑的膜，同時優化轉膜時間，關於高分子量蛋白可能需求更長的轉膜時間。

④ 抗體的運用。抗體的反響種屬與實驗類型需求可以滿足實驗的需求，此外，抗體的稀釋比、孵育時間等問題也需求在實驗中不時優化；

⑤ 蛋白與抗體分離率低。減少洗膜次數或縮短洗膜時間，降低洗膜液中 NaCl 濃度等；

⑥ 抗原被封鎖液遮蓋。換用不同的封鎖液，優化封鎖液中蛋白質濃度並縮短封鎖時間；

⑦ 甲醇濃渡過高。會招致蛋白質與 SDS 別離，並沉澱在凝膠中，同時使凝膠收縮或變硬，從而抑止高分子量蛋白的轉移。實驗中可恰當降低甲醇濃度或者運用乙醇、異丙醇替代。

二、非特異性條帶或條帶位置不對

WB 結果中目的條帶之外的條帶被稱為非特異性條帶，有時非特異性條帶很明顯，卻沒有目的條帶，這些狀況對結果剖析會產生很大的干擾。普通來說惹起這類問題的主要要素有：

① 抗體的非特異性分離。通常以為，多抗的特異性不如單抗，更容易產生非特異性條帶，而恰當降低抗體的濃度有助於減少雜帶。同時為了掃除二抗非特異性分離的可能，倡議設二抗陰性對照；

② 樣品蛋白量過高。恰當降低上樣量，同時延長洗濯時間與封鎖時間可防止蛋白量過高對實驗結果的不良影響；

③ 蛋白質降解。會招致條帶位置變化並產生更多雜帶，倡議採用新穎制備的或是凍融次數較少的樣品；

④ 細胞傳代次數過多。會招致蛋白表達形式的分化，倡議運用原始或傳代少的細胞株；

⑤ 蛋白存在復合物。有的目的蛋白會和其他蛋白分離構成復合物，招致條帶位置改動，需求查閱相關文獻來肯定蛋白能否會構成穩定復合物；

⑥ 蛋白存在剪接體或多種修飾方式。局部蛋白存在剪切位點，有的剪切體具有免疫活性，在 WB 中也會被檢測出。此外有的目的蛋白會存在糖基化位點或其他修飾位點，條帶大小可能會遠超理論分子量。因而需求查閱文獻或是 uniprot 來得知蛋白的剪切體大小以及修飾位點等。

三、背景過高

在局部 WB 結果中，條帶之外本應是空白的背景也會有較深的顏色，對剖析結果會產生干擾，而且結果圖不美觀，難以用於文章發表。這種問題的可能緣由有以下幾點：

① 封鎖不充沛。背景過高的主要緣由之一是封鎖有問題，倡議運用適宜的封鎖劑（脫脂奶粉、BSA 等），優化反響濃度與封鎖時間，同時留意防止呈現抗體與封鎖劑的穿插反響，以及封鎖劑與含有目的抗原，內源性生物素或者與抗生物素蛋白/鏈霉親和素不相溶等問題；

② 洗膜不充沛。恰當增加洗膜次數弛緩沖液體積，進步吐溫20的百分比可改善由洗膜不充沛招致的背景高的問題；

③ 抗體的運用。一抗濃渡過高是高背景的緣由之一，且二抗也存在與封鎖劑非特異性分離的可能，因而倡議恰當優化一抗濃度，並設二抗陰性對照；

④ 曝光時間長。倡議在實驗中採用適宜的曝光時間。

四、條帶彌散或外形怪異

有時 WB 結果圖中條帶位置契合預期，但卻由於條帶彌散、外形怪異等要素招致無法運用，呈現這種狀況多半是制膠或電泳過程出了問題，詳細如下：

① 電泳時電壓、電流過高。會招致條帶遷移速率過快以及 SDS-PAGE 溫度升高，並可能使得條帶彌散、外形變形。倡議運用適宜的電泳條件並堅持低溫；

② 電極不均衡。會招致條帶偏斜，上樣時在無樣品的膠孔中參加等量樣品緩沖液可防止這種狀況；

③ 上樣量過高，樣品中鹽離子濃度較大。上樣量過高可能會招致條帶彌散，樣品中的鹽離子濃度不分歧則會招致條帶不齊等問題。因而在上樣時需保證樣品量分歧且恰當，並堅持相同的、較低的鹽離子濃度。

④ 制膠問題。在配膠時一定要保證充沛混勻，平均凝膠，上樣前用針頭將膠孔撥正並吹出膠孔中的氣泡。

⑤ 電泳緩沖液寄存過久。電泳實驗中的緩沖液假如放置過久也會對結果有不良影響，因而倡議及時改換新的緩沖液。

五、膜上分布不平均的污點

有時在 WB 做出結果後，除了目的條帶以外，膜上還散布著不規律的污點，對結果也會有較大的干擾。這類問題產生的主要緣由有以下幾點：

① 試劑、儀器等污染。倡議在每次實驗前後留意清算實驗儀器，同時及時改換呈現問題的試劑；

② 轉膜時有氣泡。確保在轉膜過程中將氣泡掃除潔凈；

③ 抗體孵育時與膜接觸不充沛。確保在抗體孵育過程中，液體總量足夠，同時將抗體平均配置，並在搖擺的條件下停止孵育；

④ 曝光時間。過度曝光會招致斑點更明顯，倡議採用適宜的曝光時間；

⑤ 膜枯燥。實驗中要保證有充沛的反響液，防止呈現干膜現象。

Ⅵ SDS-PAGE和western-blot有區別嗎

前一個只是把蛋白進行電泳分析，主要用於蛋白純度分析及分子量分析，主要用於定性；後者則是在前者的基礎上又經過了轉膜及雜交等步驟，用於分析特定蛋白的表達多少的。

Ⅶ westernblotting轉膜是根據什麼原理

western blot中封閉主要是起去除非特異性吸附的作用
在western blot轉膜時，PVDF膜在甲醇活化後是帶電的，因而在轉膜時會將蛋白吸附。封閉的目的就是要將PVDF膜上無蛋白的部分空隙用奶粉填滿，以免孵抗體的時候一抗二抗與之結合，產生非特異條帶或者是背景雜亂。
所以western blot中封閉主要是起去除非特異性吸附的作用

Ⅷ 關於小分子蛋白的Western-blot問題，實驗時的膠濃度，電壓，轉膜條件等等

我最小也只做過十幾KD的。但是根據原理呢主要有以下注意事項：

1。當然是膠的濃度。9kda的話要適當增大，15-20%應該差不多吧。如果實在不行還能考慮用gradient gel。

2。二是轉膜緩沖液，內要含20%甲醇，新鮮配製，反復使用的話注意甲醇會蒸發掉。如果連續使用的話兩三次應該還可以。甲醇一是能夠洗掉跑膠時泡透了的SDS(SDS使蛋白帶負電，方便移動)，二是幫助蛋白固定到膜上面。它同時有收縮膠的孔徑的副作用，但對小分子無影響。
3。三是膜的孔徑。很多常規的膜孔徑為0.45um。你如果做小分子，17kd以下都跑掉了，那你應該試試0.2um孔徑的膜。有一個小訣竅是轉膜時疊兩張膜一起轉，如果小分子蛋白跑過了前面一張膜，那總還有可能被後面一張膜抓到。
4。四是轉膜時間。小分子的話就不要過夜轉，採取100V一小時應該就可以了，注意降溫。