消化脂肪的膠原酶怎麼配置

① 請教：常用的內皮細胞培養基

上皮細胞培養1)表皮細胞培養1.取材：取外科植皮或手術殘余皮膚小塊,以角化層薄者為佳,早產流產兒皮膚更好,切成0.5～1 平方厘米小塊.2.EDTA 處理：先置入0.02%EDTA 中室溫置5 分鍾.3.冷消化：換入0.25%胰蛋白酶中,置4℃過夜.4.分離：取出皮膚,用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開.5.溫消化：取出表皮單獨處理,用剪刀剪成更小的塊後,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化30～60 分鍾.6.用吸管輕輕反復吹打,使成細胞懸液.7.培養液：通過80 目不銹鋼紗網濾過後,低速離心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清,製成細胞懸液,接種入碟皿中,CO2 溫箱培養.2) 乳腺組織培養直接培養法：(適於培養含纖維少的軟組織)1.在含有少量培養液或Hanks 液的容器中,用鋒利刀片將組織反復切割成碎塊.2.把組織碎塊連同液體注入離心管中,再補加少許培養液,用吸管吹打片刻,置試管架3～5 分鍾.吸除上層液可排除非乳腺細胞部分.重復2～3 次.3.末次處理結束後,向沉降管中再補加培養液,用吸管稍吹打,使沉降物重懸.不待細胞團塊下降立即通過3～4 層無菌紗布濾入另管中.4.調整好適宜密度,接種入培養瓶中培養.膠原酶消化法：(適於處理含纖維多的較硬組織)其過程與培養其它組織相同.3) 胃上皮細胞培養1.取材：取胃潰瘍或胃癌手術切除胃標本遠端非病變區粘膜少許.2.清洗：用含慶大黴素(400 微克/毫升)和二性黴素(2 微克/毫升的Hanks)液漂洗後,用鈍器剝離下粘膜,剪成1mm3 大小.3.消化：在I 型膠原酶和透明質酸酶中,於37℃中消化80 分鍾.4.離心：收集細胞懸液,800 轉/分離心後,Hanks 液漂洗兩次.5.接種：末次離心後加入含有1%～2%胎牛血清的完全培養基,接種入不同孔數的培養板中,接種量依不同實驗目的而定.4) 肝細胞培養初代組織塊培養：取新鮮肝臟,先剝除被膜和血管等纖維成分,用刀或剪刀把肝臟剪成1mm3 左右的小塊,採用帖壁培養法.初代消化法培養：1.把肝組織切成2～4 立方毫米的小塊,用不含鈣鎂的BSS 液洗兩次.2.移入1：1 的0.1%胰蛋白酶和0.1%膠原酶(都用無鈣鎂BSS 配置)中,4℃冷消化10～12 小時後,通過250 微米和64 微米尼龍網或不銹鋼紗網濾過.3.收集細胞、BSS 液洗1～2 次、計數、接種培養.消化培養肝細胞的另一種方法是灌流法(肝臟灌流需用全肝,以較小動物如小鼠和大鼠為好)：1.無菌解剖動物,取出肝臟,先用BSS 洗除血污.2.取5ml 注射器一支,吸取消化液後,把注射器頭輕輕插入肝管中,用線繩結扎牢固,以防消化液漏出,輕輕把消化液注入肝管系統,並不時輕揉壓肝臟,以便消化液進入肝小葉中;消化液在肝內停留20～30 分後,在吸出消化液的同時並輕揉壓肝臟,以使肝細胞脫落和消化液吸出.3.待吸凈消化液後,注入離心管中,低速離心分離,用RPMI 1640 培養基培養(較其它培養基為好),能獲得較純的肝上皮細胞和獲較好的效果.傳代培養：待細胞生長連接成片後,用BSS 洗一二次,加1：1 的0.025%胰蛋白酶和0.02% EDTA 混合消化3～5 分鍾,待細胞回縮,便停止消化,棄掉消化液,用BSS洗一二次,注入營養液,吹打,製成細胞懸液,再接種培養.5)內皮細胞培養1.取產後的新鮮臍帶.如不立即培養可以保存於4℃中,但不宜超過12 小時.無菌剪取長10～15 厘米一段.其它如胚胎和幼體動物的大血管,亦可用於培養.2.先用三通注射器吸溫PBS 液注入臍帶的靜脈中,洗除殘血,注入口處宜用線繩結扎,以防液體返流.3.用血管鉗夾緊臍帶一端,從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為0.1%的膠原酶,待末端出現液體後結扎之,令充滿血管,注入口亦應結扎,以防液體返流,消化3～10 分鍾.4.吸出含有內皮細胞的消化液,注入離心管中,為獲取更多細胞,可再注入溫PBS 沖洗2～3 次徹底清除干凈殘余細胞,一並注入離心管中離心.5.吸除上清,加1640 培養液,製成細胞懸液,接種入瓶皿中培養,順利時2～3 天內細胞即可長成單層.6)毛細血管內皮細胞培養腫瘤條件培養基制備：1.取C3H 小鼠的S-180 實體肉瘤組織.2.胰蛋白酶消化,Dulbecco 改良Eagle 氏培養液15ml(含10%小牛血清),接種到T-75 Falcon 產培養瓶中培養.3.在細胞生長接近完全匯合時,收集培養液製成條件培養基;再用含10%小牛血清的新培養液後,也每隔兩天收集一次,可獲得多量條件培養基.4.4000 轉/分離心後,再通過0.22μm 微孔濾膜濾過,-20℃凍存備用(臨用前融解).初代培養：1.取材：取新鮮牛腎上腺數個,先用Hanks 液洗除血污.2.剝除被膜,分離出皮質,切成1 立方毫米小塊,加0.5%膠原酶室溫中消化1 小時,每隔10 分鍾用吸管吹打懸液令消化充分.3.通過不銹鋼紗網濾過,網眼要求只允許能通過小於110 微米長的毛細血管小段.4.650rpm,4℃,離心7 分鍾後,棄掉上清膠原酶.5.沉澱物用培養液重懸並離心,再重懸,再離心,共兩次.6.末次沉澱物仍用含有10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle 氏培養液重懸後,稍吹打.7.接種於鋪有明膠底層的培養皿中,37℃培養,在培養頭1～3 小時中,毛細血管小段和內皮細胞最先帖附於底物上,而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養液中漂浮.8.趁此時,吸除培養液,再加入腫瘤條件培養液,每兩天換液一次.毛細血管小段一般成自1～4 個內皮細胞,以後每個小段在底物上慢慢展成特殊形態的細胞島,能持續2～5 天.毛細血管內皮細胞分離培養：1.初代培養2～3 天後,鏡下確認幾個毛細血管內皮細胞島,在培養皿背面,用不脫色筆劃圈圈起.2.鏡下檢查,如圈內殘有非內皮細胞時,可用顯微細針在倒置顯微鏡下挑除.此操作用細胞解剖器或用手操作均可,宜在凈化台無菌氣流中、打開培養皿蓋進行,但時間不宜過長(15～20 分鍾),圈內非內皮細胞可用無菌膠刮除.3.用培養液漂洗兩次,以去除漂浮細胞.4.剩餘內皮細胞島如小(5～20 個細胞)而少時,生長增值變得緩慢或不完全不生長,此時需加入3T3 等飼細胞,飼細胞接種量為4000 細胞/cm2.5.當內皮細胞充滿所有飼細胞空間後,用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養基.6.接種入明膠底物皿中繼續培養(飼細胞死亡淘汰),細胞增殖生長匯合後,按1：5 傳代.

② Collagenase D是否就是Collagenase IV

膠原酶的化學名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構，而不損傷其它蛋白質和組織。膠原酶的化學本質是一種蛋白質，因此，這對溫度、PH和導致蛋白質變性的各種因素均非常敏感，極易受到外界條件的影響而改變其本身的構象和性質。 膠原酶按其存在的方式不同可分為人體內源性膠原酶和葯用膠原酶兩種。人體內源性膠原酶是指人體內部本身所具有的膠原酶，如牙齦、觸膜等上皮組織和關節滑膜、椎間盤內都不同程度的存在著這種膠原酶，它在體內膠原蛋白的分解過程中發揮著不可或缺的作用。葯用膠原酶是指利用生物制葯的高科技手段從溶組織梭狀芽孢桿菌的發酵液中提取、純化並精製而得的白色或類白色無菌凍乾粉針生物制劑。 膠原酶（collagenase）是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結締組織中膠原蛋白成分。當擬消化的組織較硬，內含較多結締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細胞的效果較差，這時可採用膠原酶解離細胞法。 膠原酶僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。因此適於消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%。膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶，要根據所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。 1、膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用於哺乳動細胞的分離。 2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。 3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用於胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞。 4、膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。 膠原酶的配置 膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。 注意： 因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。 鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。 膠原酶的使用 1.將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm3左右小塊 2.將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。 3.將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內，每隔3min振搖一次，如能放在37℃的恆溫震盪水浴箱中則更好。 消化時間與組織的類別很有關系，對於某些腫瘤組織或其他較緻密結締組織，消化時間4~48h，對於容易消化的組織可以採用37℃震盪消化15~45min，也可以根據具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經膠原酶消化後，由於上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。 4.收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用100目不銹鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者無血清培養液離心漂洗1~2次，去除上清，加培養液製成細胞懸液，接種培養瓶。

③ 哪位做過脂肪細胞原代培養

方案 23.12 脂肪細胞的原代培養

實驗材料

DMEM-ADMEM-B膠原蛋白酶雄性 Sprague-Dawley 大鼠

試劑、試劑盒

KRBH緩沖液KRBH-A緩沖液

儀器、耗材

Petri培養皿錐形離心管聚丙烯管低密度聚丙烯瓶尼龍濾網尖解剖剪Perry鑷塑料箱鍘刀移液器

實驗步驟

一、切除附睾脂肪墊

1. 在充有 70 % CO2和 30 % O2混合氣體的塑料箱內麻醉大鼠（雄性 Sprague-Dawley 大鼠：145~170 g，CD 系（Charles River Breeding Laboratories）。

2. 用鍘刀斷頭放血。

3. 將鼠體在 70 % 乙醇內浸泡一會兒。

4. 盡量在無菌條件下切除附睾脂肪墊。

(a)用一把解剖剪剖開下腹部皮膚，暴露腹膜。

(b)用另一把解剖剪剖開腹膜，然後用 Perry 鑷向上牽拉睾丸。

(c)剪取附睾脂肪墊，注意保留血管。

5. 將組織移送到培養實驗室。

脂肪細胞的膠原蛋白酶（在 2 ml KRBH 緩沖液加入 20 mg/ml 膠原蛋白酶，然後用 0.22 μm 濾器過濾）消化和洗滌

6. 將 4 g 脂肪墊（相當於 8 個附睾的脂肪墊）放入盛有 4 ml KRBH 緩沖液 （Krebs-Ringer 液，pH 7.4，添加 10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES（Sigma）、200 nmol/L 腺苷（Boche）和 1 % BSA （W / V，Intergen）。配製 1 L KRBH 緩沖液時，用 7 g NaCl、0.55 g KH2PO4、0.25 g MgSO47H2O、0.84 g NaHCO3、0.11 g CaCl2、7.15 g HEPES、10 g BSA、1 ml 200 μmol/L 腺苷， 加超凈水至 1 L。然後，按 100 ml 分裝。使用前加熱至 37°C，並將 pH 調整至 7.4。）（37°C）的 30 ml 低密度聚丙烯瓶內。

7. 將脂肪墊剪成直徑約為 2 mm 的組織塊。

8. 將組織塊放入瓶內，然後加入 1 ml 膠原蛋白酶液。在 37°C 水浴振盪器孵育約 1 h，直至細胞混合物形成乳脂樣濃稠液體。

9. 膠原蛋白酶消化後，向瓶內加入 4 ml KRBH 緩沖液（37°C）。

10. 通過攪拌混勻瓶內的細胞，然後用孔徑為 250 μm 的尼龍濾網（孔徑為 250 μm，放入支持物或漏斗內）將細胞輕輕濾入 50 ml 錐形離心管。

11. 通過向離心管內加入 30 ml KRBH 緩沖液（37°C）洗細胞。用台式離心機短時間離心（ 200 g），然後用吸管吸出下清液。注意脂肪細胞浮在水性緩沖液的上面。

12. 通過加入 40 ml KRBH 緩沖液洗細胞，離心，除去下清液。重復該步驟 1 次。

13. 用 40 ml DMEM-A （DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨醯胺、200 nmol/L（R )-N6-（l-methyl-2-phenylethyl）腺苷（PIA，Sigma）、100 μg/ml 慶大黴素和 25 mmol/L HEPES。按 100 ml 分裝，使用前加熱至 37°C）（37°C）洗細胞 2 次。

14. 用約 40 % cytocrit DMEM-A 混懸漂浮的細胞。

二、脂肪細胞的原代培養

15. 用 200 μl 大口徑吸頭將 2 ml 40 % cytocrit DMEM-A 懸液移入 60 mm 培養皿。

16. 將培養皿放入濕潤的培養箱，在 37°C 和 5 % CO2的條件下培養 1.5 h 。

17. 向培養皿內加入 5 ml DMEM-B（DMEM-A，添加 7% BSA）。

此時，應進行葡萄糖攝取實驗 [ Quom 1998 ]，檢査細胞的活力。

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中山醫科大學學報(AcadJSUMS),2001,22(6):443~446443

人前脂肪細胞的原代培養

王竹晨1,劉建中2,李??燕2,楊冬梓1,鄺健全1

(中山醫科大學??1.孫逸仙紀念醫院婦產科,2.生物教研室,廣東廣州??510120)

摘??要:??目的 建立人前脂肪細胞原代培養方法,以更深入地研究人體脂肪組織增生的生物學特徵。??方法 選用成人的腹部脂肪組織,採用原代消化細胞培養法培養出棱形細胞;同時取皮膚組織,進行成纖維細胞培養作為對照。??結果 培養出的棱形細胞成分均一,增殖旺盛,分化率高。經形態學動態變化的觀察,生長曲線及油紅O脂肪染色抽取法測定,證明是功能活躍的前脂肪細胞,並在體外重現了其增殖的全過程。??結論 在成熟的脂肪組織中存在著可分化成熟、生成脂肪的前脂肪細胞。由於脂肪細胞是胰島素作用的經典靶細胞之一,本實驗為進一步研究與肥胖及胰島素抵抗相關的疾病如多囊卵巢綜合症等打下了基礎。

關鍵詞:前脂肪細胞;細胞培養;脂肪組織

中圖分類號:Q254,R711.75??????文獻標識碼:A??????文章編號:1000-257X(2001)06-0443-04

WANGZhu??chen1,LIUJian??zhong2,LIYan2,YANGDong??zi1,KUANGJian??quan1

(1.,SunYat??senMemorialHospital,2.DepartmentofBiology,

SunYat??,Guangzhou510120,China)

Abstract:??Objective .??Methods Usingprimarycellculture,fibroblast??..??Results Thecellswerehighlyhomogeneous,.,growthcurve,,.Undercontrolledconditions,.??Conclusion Inmaturehumanadiposetissue,.,thisstudylaidthebasisforfur??syndrome.

Keywords:preadipocyte;cellculture;adiposetissue

????脂肪細胞是胰島素作用的經典靶細胞之一,與

肥胖及胰島素抵抗相關疾患如多囊卵巢綜合症的

研究關系密切,近年來受到婦科內分泌領域的重

視。前脂肪細胞是一類具有增殖和向脂肪細胞分

化能力的特異化的前體細胞,它的存在和作用持續

於人的一生,我們從人脂肪組織中培養出了前脂肪

細胞,為進一步研究打下了基礎。

????收稿日期:2001-04-23

????基金項目:廣東省衛生廳科研基金資助課題(2001189)

????,;1??材料與方法1.1??組織來源選取2000年9月~2001年1月本院婦科內分泌病房行輸卵管復通術的正常體重患者。年齡20~40歲,身體健康,無其他急慢性疾病。術中開腹時切取皮下脂肪組織及皮膚組織。

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1.2??試驗材料

1.2.1??主要試驗用品和化學試劑??DMEM/F??12培養基(1!1),無支原體胎牛血清,?型膠原酶,Hepes,人轉鐵蛋白,青、鏈黴素原液均購自GIBCO公司;生物素、泛酸鹽、氫化可的松,三碘甲狀腺原胺酸(T3),3??異丁基??1??甲基黃嘌呤均系SIGMA公司產品。牛血清白蛋白購自Roche公司。試驗所需無機試劑購自廣州市醫葯公司化試批發部,均系分析純試劑。培養瓶購自KORNING公司。

1.2.2??培養基及主要試劑的配製??培養基A[1]中山醫科大學學報(AcadJSUMS),2001,22(6)培養基A製成細胞懸液,接種至25cm2培養瓶內,密度為每平方厘米3?10個細胞,置37#,體積分數5%CO2培養箱內孵育16h後,PBS輕輕洗去培養瓶內未粘附的物質,換用培養基C誘導和維持脂肪細胞分化,3d後更換為培養基B,以後每2~3d更換一次培養基B。1.3.2??人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞的組織學染色??蓋玻片剪成0??5cm?1??0cm大小,接種時置入培養瓶內,待細胞貼壁後每2、3d從培養瓶內取出染色。將貼有脂肪細胞的面朝上,浸入體積分

數為10%甲醛的等滲鹽緩沖液中固定10min,然後放入PBS緩沖液中,輕輕漂洗片刻,直立使殘留水份流到邊緣,吸水紙吸掉。稍乾燥後,人前脂肪細胞採用蘇丹%??&滴染法及Mayer蘇木素復染細胞核,甘油明膠封片;皮膚成纖維細胞採用常規蘇木素-伊紅染色,脫水透明後中性樹脂封片,光鏡觀察並拍照保留結果。

1.3.3??細胞生長曲線的繪制??將細胞懸液等量接種至24個培養瓶內,隨機分成8組,每組3瓶,每2d檢測一組中每個瓶中的細胞總數,取3個瓶的均值,如此至第8組結束。細胞計數方法參照醫學細胞生物學實驗[3]。

1.3.4??油紅O染色提取法測定細胞內的脂肪含量??接種方法同1.3.3,根據Ramirez[2]4:按說明取DMEM/F??12培養粉5g,加入胎牛血清使其體積分數為10%,三蒸水定容至500mL;培養基B:按說明取DMEM/F??12培養粉10g,加入終濃度分別為15mmol/LNaHCO3,15mmol/LHep??es,33??mol/L泛酸鹽,17??mol/L人轉鐵蛋白,100000U/L青黴素,0??1g/L鏈黴素,100nmol/L氫化可的松,60nmol/L胰島素,0??2nmol/LT3,三蒸水定容至1000mL;培養基C:取培養基A200mL,加入3??異丁基??1??甲基黃嘌呤,使其終濃度為0??25mmol/L;消化液:稱取膠原酶(?型)150mg,牛血清白蛋白2g,0??01mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)定容至100mL;紅細胞溶解緩沖液:稱取適量NH4Cl,K2HPO4和EDTA,使其終濃度分別為154mmol/L,5??7mmol/L,和0??1mmol/L,三蒸水

定容至250mL。上述溶液均經調整pH值至7??4~7??6,0??22??m微孔濾膜正壓過濾除菌,分裝後置-30#保存。油紅O工作液[2]等的方法測定。培養物用體積分數10%甲醛的等滲鹽緩沖液固定1h後,蒸餾水漂洗。吸取油紅O工作液10mL,使培養面向下浸染,2h後倒掉瓶內的油紅O

工作液,蒸餾水漂洗培養瓶數次,直至完全漂浮干凈。將已染色的培養瓶置於32#孵箱內蒸發掉瓶內的水份後即加入1mL異丙醇,萃取出的染液即刻用吸管移出,於HITACHIG2000型分光光度計510nm波長處測吸光度。:稱取4??2g油紅O溶於1200mL異丙醇中室溫靜置過夜,分析濾紙過濾後收集濾液,並加入900mL三蒸水,於4#再次靜置過夜後過濾兩次即可於室溫貯存備用。1.2.3??儀??器??CO2培養箱,倒置顯微鏡等。1.3??方??法

1.3.1??人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞的原代培養[1]??術中切取脂肪組織約60g,同時切取皮膚組織約0??5cm?3cm進行成纖維細胞培養作為對照。PBS洗滌,分離去除脂肪組織中肉眼可見的纖維成份及血管,皮膚組織則需去除表皮和皮下脂肪,剪碎成約2mm?2mm的小塊,加入消化液,置37#,體積分數5%CO2培養箱內消化。15h後,200?g短時離心,去除漂浮的脂肪細胞及培養液,沉積的細胞用紅細胞溶解緩沖液再次配成細胞懸液,37#孵育10min,以去除污染的紅細胞,150??2??結??果2.1??原代培養的人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞形態學觀察細胞貼壁後初為小圓形,核/漿比例較大(圖1??1),4d即可觀察到細胞漸成梭型,7d左右此棱形細胞大量繁殖,面積達到培養瓶底1/2之後開始積聚脂肪顆粒(圖1??2)。9d可觀察到細胞由棱形漸變成橢圓形或圓形(圖1??3),積聚有脂肪顆粒的

第6期??王竹晨,等.人前脂肪細胞的原代培養445肪細胞(圖1??4)。體外培養的脂肪細胞體積較大,細胞膜較薄,膜輪廓不光滑,凹凸不平有皺折,胞質內有大量圓形脂滴,大小不等且多散在,也有小脂滴大量觸合成大脂滴的情況,核仍位於邊緣,而同時培養的皮膚成纖維細胞增殖速率相似,但始終為長棱形,無脂滴積聚(圖2??1,圖2??2)。

2.2??人前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞的生長曲線

由生長曲線可見人前脂肪細胞(圖3??1)和皮膚成纖維細胞(圖3??2)的倍增時間分別為60h和55h

。3??討??論3.1??人前脂肪細胞培養在婦科內分泌領域的研究意義脂肪細胞是脂肪組織的重要組成部份,也是其發揮功能的主體。當代研究認為脂肪組織中脂肪細胞非常活躍,細胞的數目,形態及細胞內脂肪的含量均處於動態變化之中,並保持終生。肥胖症被認為是脂肪細胞增殖和分化失控的結果。目前,肥

胖已成為與婦科內分泌領域密切相關的疾病,肥胖可產生胰島素抵抗/高胰島素血症,而胰島素抵抗/高胰島素血症是許多臨床疾病或病症,尤其是常見的內分泌代謝性疾病如糖尿病、高血壓和動脈粥樣硬化等的共同危險信號,因此成為近年醫學多學科共同感興趣的研究熱點。特別是近年的研究發現

圖3.1??人前脂肪細胞生長曲線

Fig.3.1??

culture胰島素抵抗/高胰島素血症還與育齡婦女高雄激素血症及無排卵有關。臨床常見的多囊卵巢綜合症,

生育年齡婦女中約有5%~10%患者此症,常伴有肥胖,病因不明。目前認為多囊卵巢綜合症即是以胰島素抵抗為特徵的內分泌代謝性疾患,繼發於胰島素抵抗的高胰島素血症對造成高雄激素徵象起著重要作用,並致不孕[4]。脂肪細胞作為對胰島素

圖3.2??人皮膚成纖維細胞生長曲線

Fig.3.2??敏感的靶細胞之一,因此對其潛在胰島素抵抗機制的研究具有特殊臨床意義。體外前脂肪細胞培養

能完整地認識脂肪組織的發生和增生的全過程,並且可以直接觀察各種因素對這個過程的調控,研究其機制,是研究脂肪組織的理想模型。國外雖已建立了來源於鼠的前脂肪細胞的細胞株如3T3??L1、3T3??F442A,ob17系列等,但到目前為止,尚未見有人的前脂肪細胞株建立[5],因而使進一步的研究受到了限制。

3.2??體外培養的人前脂肪細胞的生物學特性

目前國內外前脂肪細胞體外培養系統大致有兩類,一類來源於血管基質組份細胞(stromalvas??cularfraction,SVF),這是經典的前脂肪細胞。Van等[6]對SVF的系統研究形成了完整的前脂肪細胞理論。他們將切下的脂肪組織用膠原酶處理,再將組織懸液離心,其中的沉澱物基質血管成份即是SVF,將其SVF進行培養,和培養的成纖維細胞比較,這兩種培養物以差不多的速率增殖,倍增時間約55h左右。在顯微鏡下比較細胞,發現起初2.3??前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞生長過程中細胞內脂肪含量的變化前脂肪細胞內的脂肪含量於培養9d後迅速增加,16d左右到達高峰,而皮膚成纖維細胞內僅有極少的脂肪積聚(圖4)

。圖4??前脂肪細胞及皮膚成纖維細胞生長過程中細胞內脂肪含量的變化Fig.4??lture

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可積聚大量脂滴,而成纖維細胞的胞漿內則無或只有少量的脂滴。這就證明了SVF是具有增殖和向脂肪細胞分化潛能的前脂肪細胞。本實驗研究結果與之相符,符合文獻中提出的3個標准[6]。此外,近年還有人報道採用脂肪組織塊貼壁和天花板培養相結合的方法也獲得了成功[7]。此種方法得到的前脂肪細胞與SVF不同,可能來源於Carraro等發現的成熟脂肪細胞內都有的一種細胞島[8]。但此種方法是採用有血清培養並且與成熟脂肪細胞共同孵育,不適於作為成熟脂肪細胞所分泌的某些細胞因子的體外研究模型。

前脂肪細胞的培養闡明了其增殖和分化的關系,目前認為這是一種生長停頓?生長再續?細胞分化的連續關系。生長停頓是必要的第一步,此後這些細胞至少進行一次以上的再分裂,才繼續向成熟脂肪細胞轉化。並隨時間的推移出現甘油??3??磷酸脫氫酶(GPDH)mRNA這個晚期標志物,這也是脂肪合成所必需的限速酶,並最終變成脂肪細胞。我們的研究也觀察到細胞貼壁後經過一段時間的潛伏期後開始生長,3、5d左右大量增殖,1周後開始有脂肪顆粒的積聚。培養2周時,分化成多脂滴或單脂滴的脂肪細胞,與文獻報道一致。

油紅O染色提取法可簡便、快速地對體外培養的前脂肪細胞轉化率進行定量。文獻報道其准確性和敏感性與測定前脂肪細胞分化過程中的標志酶GPDH相似[2]。因此常用來作為對體外培養的前脂肪細胞進行鑒定。體外培養的前脂肪細胞在胰島素、氫化可的松等的作用下,GPDH即開始上升並迅速增加,8d左右達到高峰並維持在高水平[2]。我們採用油紅O染色提取法進行研究,結果表明,前脂肪細胞在培養第3天即開始有脂肪的積聚,1周後積聚量明顯增多,2周時達到高峰,與形態學上的培養1周後細胞內開始出現脂肪顆粒相吻合。並說明酶的出現在先,脂肪出現在後,細胞內脂肪含量的明顯增加比GPDH的出現要晚1周左右,與文獻報道相吻合[2]。

3.3??人前脂肪細胞培養技術的特點

脂肪組織來源於原始的網狀結締組織,由結締組織和脂肪細胞組成,細胞成分中以脂肪細胞為主,此外還含有網狀細胞,間充質細胞,組織細胞,內皮細胞等。脂肪細胞和成纖維細胞均來自中胚層,因此培養脂肪細胞和培養成纖維細胞具有相似[9]中山醫科大學學報(AcadJSUMS),2001,22(6)外培養條件有差異[10],不同的是需要促脂肪形成因子的作用,目前已知的這類物質有:胰島素、糖皮質激素、甲狀腺素、生長激素、轉鐵蛋白,3??異丁基??1??甲基黃嘌呤,纖維粘連素等。培養基一般採用DMEM和F12按1!1比例配製,細胞數量適中,初次接種時細胞貼壁不十分牢固,動作要輕柔以免細胞漂浮。選用的取材對象越年輕越容易生長。人類一般選用外科手術切取腹部脂肪組織,如用注射器抽吸則易損傷細胞,降低成活率。(本文圖1,2見插頁2)參考文獻:[1]HaunerH,PetruschkeTH,RussM,etal.(TNF??)??[J].Dibetologia,1995,38(7):764.[2]Ramirez??ZacariasJL,Castro??MunozledoF,kuri??Har??cuchW.??[J].Histochemistry,1992,97(6):493.[3]趙??剛,劉建中.醫學細胞生物學實驗與習題[M].北京:科學出版社,1999.35.[4]DunaifA.??drome[J].Endocrinol&MetabClinNorAm,1999,28(2):341.[5]BillingsE,MayJW.Historicalreviewandpresentsta????constructivesurgery[J].PlastReconstrSurg,1989,83(2):368.[6]VanRLR,BaylissCE,RoncariDAK.rsinculture[J].JClinInvest,1976,58(9):699.[7]朱曉海,何清濂,林子豪.人前脂肪細胞培養及增殖與分化模型的建立[J].中華整型燒傷外科雜志,1999,15(3):199.[8]CarraroR,LiZH,JohnsonJE.ntratadipocytes[J].CellTissRes,1991,264(2):243.[9]劉??清,鄧漪平.內皮-平滑肌聯合培養:細胞間相互作用對組織型纖溶酶原激活劑的影響[J].中山醫科大學學報,1992,13(4):18.[10]朱永源,利天增,蘇愛雲,等.人表皮細胞的體外培養[J].中山醫科大學學報,1998,19增刊:34.(??,)

④ 如何配置膠原酶2u/ml的膠原酶溶液，需要多少毫克膠原酶

梯度的配置一般高往低逐步稀釋，一般現配一個大濃度的儲備液你可以配1g/ml的，方法是稱取100g的樣品溶解後用100ml的容量瓶定容
50mg/ml的配置：量取5ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
40mg/ml：量取4ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
30mg/ml：量取3ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
,20mg/ml：量取2ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
10mg/ml：量取1ml的1g/ml儲備液稀釋後，用100ml的容量品定容
望採納，謝謝

⑤ 膠原酶的配置

膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。
注意：
因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。
鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。

⑥ 腫瘤細胞消化液中膠原酶、透明質酸、DNA酶配合什麼比例比較好膠原酶用哪個型的謝謝您的關注和回答

不同腫瘤組織 其中各種蛋白種類、比例各不相同，則相應消化酶的種類和比例也可適當改變，若要制備腫瘤懸液，個人推薦 先查找中英文文獻，參考文獻中的消化方法

⑦ 膠原酶的使用

1.將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm3左右小塊
2.將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。
3.將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內，每隔3min振搖一次，如能放在37℃的恆溫震盪水浴箱中則更好。
消化時間與組織的類別很有關系，對於某些腫瘤組織或其他較緻密結締組織，消化時間4~48h，對於容易消化的組織可以採用37℃震盪消化15~45min，也可以根據具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經膠原酶消化後，由於上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。
4.收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用100目不銹鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者無血清培養液離心漂洗1~2次，去除上清，加培養液製成細胞懸液，接種培養瓶。

⑧ 什麼是膠原酶消化法

就是用膠原酶處理消化組織達到分離細胞的目的，所用膠原酶有不同類型：
1、膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細胞，用於哺乳動細胞的分離。
2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。
3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用於胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞。
4、膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織

⑨ 誰知道0.2%Ⅱ型膠原酶和10%胎牛血清的怎麼配製

每 100mg 膠原酶加入 50ml 培養液中 攪拌
均勻 用 0.2 微米 微孔濾膜過濾分裝 -20 低溫冰箱保存

450mlDMEM+50mlFBS

⑩ 膠原酶和胰酶在細胞原代培養中的區別

膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用，作用對象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。消化原代培養的上皮類細胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應用的消化劑.胰蛋白酶是一種胰臟製品,對蛋白質有水介作用,主要作用於賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開,在常用的蛋白酶中由於產品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的作用,取決於細胞類型、酶的活力、配製的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等.

膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶,對膠原有很強的消化作用.適於消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細胞間質有較好的消化作用,對細胞本身影響不大,可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害.該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養液配製,即操作簡便又可提高細胞成活率,最終濃度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無需機械振盪,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本.