二型膠原酶怎麼消毒

『壹』 Collagenase D是否就是Collagenase IV

膠原酶的化學名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構，而不損傷其它蛋白質和組織。膠原酶的化學本質是一種蛋白質，因此，這對溫度、PH和導致蛋白質變性的各種因素均非常敏感，極易受到外界條件的影響而改變其本身的構象和性質。 膠原酶按其存在的方式不同可分為人體內源性膠原酶和葯用膠原酶兩種。人體內源性膠原酶是指人體內部本身所具有的膠原酶，如牙齦、觸膜等上皮組織和關節滑膜、椎間盤內都不同程度的存在著這種膠原酶，它在體內膠原蛋白的分解過程中發揮著不可或缺的作用。葯用膠原酶是指利用生物制葯的高科技手段從溶組織梭狀芽孢桿菌的發酵液中提取、純化並精製而得的白色或類白色無菌凍乾粉針生物制劑。 膠原酶（collagenase）是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結締組織中膠原蛋白成分。當擬消化的組織較硬，內含較多結締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細胞的效果較差，這時可採用膠原酶解離細胞法。 膠原酶僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。因此適於消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%。膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶，要根據所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。 1、膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用於哺乳動細胞的分離。 2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。 3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用於胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞。 4、膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。 膠原酶的配置 膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。 注意： 因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。 鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。 膠原酶的使用 1.將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm3左右小塊 2.將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。 3.將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內，每隔3min振搖一次，如能放在37℃的恆溫震盪水浴箱中則更好。 消化時間與組織的類別很有關系，對於某些腫瘤組織或其他較緻密結締組織，消化時間4~48h，對於容易消化的組織可以採用37℃震盪消化15~45min，也可以根據具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經膠原酶消化後，由於上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。 4.收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用100目不銹鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者無血清培養液離心漂洗1~2次，去除上清，加培養液製成細胞懸液，接種培養瓶。

『貳』 膠原酶的配置

膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。
注意：
因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。
鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。

『叄』 我想查一下膠原酶的作用

膠原酶是人體內源性膠原酶是指人體內部本身所，具有的膠原酶如牙齦、觸膜等上皮組織和關節滑膜、椎間盤內都不同程度的存在著這種膠原酶它在體內膠原蛋白的分解過程中發揮著不可或缺的作用。要補充膠原酶只要一點點輔助作用對腰間盤明顯根本沒有什麼效果的

『肆』 細菌代謝產物中不易被高壓蒸汽滅菌法破壞的是什麼

熱原質。
（pyrogen）即菌體中細胞壁的脂多糖，大多是革蘭氏陰性菌產生的。注入人或動物體內能引起發熱反應，故名熱原質。
熱原質耐高熱，高壓蒸汽滅菌（121℃，20』）不能使其破壞，加熱（180℃ 4h;250℃45';650℃1'）才使熱原質失去作用。熱原質可通過一般細菌濾器，但沒有揮發性，所以，除去熱原質最好的方法是蒸餾。用離子交換劑和特殊石棉濾板也可除去液體中的大部分熱原質。葯液、水等被細菌污染後，即使高壓滅菌或經濾過除菌仍可有熱原質存在，輸注機體後可引起嚴重發熱反應。生物製品或注射液製成後除去熱原質比較困難，所以，必須使用無熱原質水制備。
外源性熱原質，可以激活中性粒細胞和單核細胞。
細菌在其物質代謝過程中，除利用各種營養物質合成菌體和產生能量外，還可產生出多種代謝產物，其中有的對人和動物是有害的，有的可供鑒別細菌之用，有的可供製醫葯之用，現將有關的代謝產物分述如下。
（一）分解產物
1、糖分解產物 細菌分解糖類後，可以產生有機酸（主要為乳酸、醋酸、丙酮酸、酪酸等）、氣體（主要為CO2、H2和沼氣等）和醇類。
2、蛋白分解產物 細菌應用各種蛋白酶分解蛋白質，其最後產物包括有機酸、胺類、靛基質、硫化氫、硫醇、CO2和氫等。
（二）合成產物
這里所指的合成產物，是指菌體成分以外的其他合成物質。

1、毒素 病原性細菌可以合成各種有毒物質，稱為毒素。毒素和細菌的致病作用有直接關系，它又分外毒素和內毒素兩種。外毒素是蛋白質，內毒素則是糖、磷脂和蛋白質的復合物。
2、酶
細菌除合成其新陳代謝所必需的酶以外，還合成以下幾種酶，這些酶在代謝過程中的作用尚不明了，但和細菌的致病性有一定關系。

①卵磷脂酶 此酶能分解細胞壁的卵磷脂，使細胞壞死或紅細胞溶解，魏氏梭菌和水腫梭菌等含有此酶。
②膠原酶 此酶分解肌纖維的網狀組織，使肌纖維發生崩解。殺鮭氣單胞菌等含此酶。 ③透明質酸酶 此酶分解組織細胞間結合物質（結締組織）的透明質酸，因而可增加組織滲透性，便於細菌和毒素的擴散。
④凝血漿酶 能使人、兔及馬的血漿凝固，葡萄球菌中的金黃色葡萄球菌含有此酶，但白色和檸檬色葡萄球菌則不含有此酶，人們通常將此酶視為葡萄球菌具有毒力的指標之一。 ⑤溶纖維蛋白酶 使血清中的溶血漿素原活化，變為溶血漿素，因而使已經凝固的血漿或血塊發生溶解。新分離的溶血性鏈球菌和葡萄球菌等含有此酶。
⑥溶血素 某些細菌產生一種能溶解動物紅細胞的溶血毒素。溶血素也是一種酶類物質。如嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和鰻弧菌等均可產生溶血素。
另外有的細菌還能合成明膠溶解酶和凝乳酶，可引起明膠液化和牛乳凝固現象。這些現象往往可以作為鑒定細菌的參考。
3、抗生素.
許多細菌、放線菌、真菌可以合成抑制或殺滅其他種微生物或腫瘤細胞的物質，稱此物質為抗生素。例如青黴菌產生的青黴素、灰色鏈絲菌產生的鏈黴素、委內瑞拉鏈絲菌產生的氯黴素和金色鏈絲菌產生的金黴素等等。
4、維生素
某些種細菌和酵母有合成維生素的能力。一般認為大腸桿菌所合成的維生素是動物所需維生素的重要來源。
5、熱原質
許多細菌，特別是革蘭氏陰性菌，能在水中發育產生一種使人或動物發生熱反應的多糖物質，稱為熱原質。
這種物質很耐熱，甚至高壓蒸氣滅菌15～20min也不能將它破壞，但可被活性炭吸附或石棉板濾除。因此普通蒸餾水若在蒸餾後保存不當，就可能含有熱原質，若注射到動物體或人體內，能引起發熱反應。在製造化學注射葯液或生物製品時，需要保證沒有熱原質存在。
6、色素
某些細菌在適宜的條件下能產生色素。其中有些溶於水，可使菌落及培養基著色。如殺鮭氣單胞菌的褐色色素。有些不溶於水，但溶於酒精。故只能使菌落本身著色，例如葡萄球菌、八聯球菌的色素。色素對於細菌的鑒別有一定價值，例如葡萄球菌的分型，按照其所產生的色素是分型的依據之一。

『伍』 鼠尾膠原蛋白I型，用那一種膠原酶可以溶解

醋酸就可以.

1．將膠原加入到0.1M 的醋酸中，制備成濃度為0.1%的溶液。在室溫中攪拌1-3小時直到完全溶解。

2．建議將溶液轉移到擰口的玻璃瓶中，並小心的在瓶底鋪上一層氯仿。氯仿的量約為膠原溶液的10%。不要晃動或攪拌。在2-8度中放置過夜。在無菌條件下轉移上層的膠原溶液。我們不建議用過濾的方法無菌化。已經發現該方法會導致丟失蛋白。

3．稀釋一定數量的膠原溶液。

4．按照6-10ug/cm2的濃度包被培養瓶。在室溫或37度結合數小時或者2-8度過夜。

5．從包被表面除去多餘的液體。過夜乾燥。如果膠原溶液不是無菌的，這時候可以在無菌細胞操作室中暴光在紫外線下過夜消毒。 在接種細胞前用無菌的水漂洗。

『陸』 膠原酶在4度冰箱放了一個月會失活嗎

膠原酶4度存放，最好1~2周內用完；
長時間貯存宜在-20攝氏度，用前可放37度溶解，但溶解時間不能過久，防止酶活性受影響；
消化組織時間：取決於消化液濃度和組織類型，一般消化時間為2－3小時或者4度過夜。

『柒』 誰知道0.2%Ⅱ型膠原酶和10%胎牛血清的怎麼配製

每 100mg 膠原酶加入 50ml 培養液中 攪拌
均勻 用 0.2 微米 微孔濾膜過濾分裝 -20 低溫冰箱保存

450mlDMEM+50mlFBS

『捌』 請教大鼠原代肝細胞的分離和培養的問題

我記得好像有這一方面的的論文，題目都一樣的《大鼠原代肝細胞的分離與培養》是徐麗娜 鞠雷 顧憲銳 張恆 馬玉忠 河北農業大學動物科技學院的
http://www.cqvip.com/qk/96216X/200712/26163977.html
你下載來看就行了（不過下載要錢）

下面我給你，我做的一個過程（僅做參考）
我做的就是大鼠原代肝細胞，養了一段時間了，下面是我的實驗步驟，希望對你有所幫助。
1）3-5天乳鼠，斷頭處死，75%酒精浸泡3-5分鍾。
2）移入超凈台內，無菌取下肝臟，放入冷PBS內，撕下被膜等。
3）移入25ml燒杯內，剪成1mm3左右大小，PBS清洗至上清無色。
4）移入三角瓶內，加5倍量0.05%胰酶37度消化20分鍾。
5）終止消化，靜置，棄上清。加0.05%膠原酶消化20分鍾。
6）100目過濾。離心，800，3分鍾。
7）計數，調整濃度，接種。24小時第一次換液，以後沒兩天換一次液，4、5天可以鋪滿。

二、方法

1．傳統門靜脈灌流消化法（傳統門脈灌流法）：參照鄒氏等文獻方法[3,4,5]。

2．低濃度膠原酶原位循環灌流法：

2.1取Wistar大鼠，用2%戊巴比妥鈉10mg/100g體重、肝素20 u/100g體重分別腹腔注射以麻醉和抗凝。

2.2 10-15分鍾後固定大鼠，75%酒精消毒，紫外燈照射15-30分鍾。腹部再次75%酒精消毒後正中切開打開腹腔並更換器械。

2.3顯露肝門部門靜脈並游離2-3cm；顯露游離肝下下腔靜脈2-3cm，各置一結扎線，暫不結扎。

2.4穿刺針插入門靜脈後立即結扎固定，盡快接通硅膠管並啟動蠕動泵（無泵時，輸液器亦可），同時剪斷肝下下腔靜脈遠端。

2.5用D-Hanks液20-30ml/min快速灌注清除肝內血液，1分鍾內即可見肝臟顏色變淺，持續灌注10分鍾至肝臟呈米黃色。同時切開胸腔結扎肝上下腔靜脈。

2.6插另一硅膠管入肝下下腔靜脈並結扎固定，換D-Hanks液為膠原酶消化液(370C預熱)循環灌注消化，灌流速度為10-20ml/min，持續時間10-20分鍾至肝質變軟，壓之凹陷不易恢復。

2.7停止灌注，小心剪取各肝葉置入消毒平皿內，加入適量肝細胞洗滌液（4oC預冷），撕碎肝臟並祛除纖維結締組織，製成混合肝臟細胞懸液。

2.8 100目篩網過濾入50ml離心管，500rpm離心1-2分鍾。去上清，沉澱加入RPMI 1640 （4oC預冷）20-30ml洗滌3次。

2.9肝細胞沉澱加入肝細胞培養液重懸為10ml，取適量計數並用0.4%台盼藍染色判斷存活率。後即可按實驗設計接種培養

我們目前正在做大鼠肝臟細胞的分離培養（原位循環灌注法），我把大體步驟和大家交流一下。
1，動物稱重，戊巴比妥麻醉。
2，固定，消毒，腹部正中十字切口，或者「U」型切口進腹。
3，分離門靜脈和肝下下腔靜脈，分別插管，從門靜脈注入肝素，使大鼠全身肝素化。
4，阻斷肝上下腔靜脈（位置較深，分離結扎有難度，可用哈巴狗血管夾夾住，亦可用消毒棉簽壓迫）
5，從門靜脈內注入D-HANKS，直至肝下下腔靜脈插管內流出來的液體中不含或含少量紅細胞，肝臟呈米黃色。
6，此時接上自製的膠原酶循環灌注裝置（循環通路：門--肝--肝下下腔--蠕動泵--門），灌注15分鍾左右，到肝臟表面呈顆粒狀為止。
7，取下肝臟，剪碎，去結締組織，放入含有膠原酶的三角瓶中繼續水浴消化10分鍾後加入HANKS 或者1640終止消化。
8，將3角瓶帶入超凈台內，在超凈台內完成以下步驟。
9，50目篩網，200目篩網，1640兩次吹打過濾。獲得細胞懸液。
10，1640洗滌離心3次，收集細胞，製成一定濃度的懸液。
11，計數，調整濃度，培養。

（大體步驟，太多細節不贅述，我們曾用此方法分離乳豬，大鼠的肝細胞，結果令人滿意）

注意點：
1，腹部切口位置要合適，避免誤入胸腔導致大鼠死亡。
2，插管要固定，避免滑脫。
3，阻斷肝上下腔可以用小哈巴狗，但我們實際發現用下毒棉簽壓迫更為簡單，效果也令人滿意。
4，所有灌流液均要預熱。
5，肝臟消化完畢後，立即拿到超凈台內操作，注意無菌觀念。
6，消化時間8宜過長。
7，組織塊比較大，通過50目篩網有困難時，可用消毒注射器活塞輕輕擠壓組織塊，勿研磨！

優點：
1，消化充分，且節約膠原酶。膠原酶比較昂貴 ：）
2，在肝臟離體之前大鼠保持呼吸心跳，從而最大限度的保持了細胞的活力。
缺點：
需要一定的手術技巧，了解肝臟循環結構，且血管插管有一定難度。

『玖』 Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶有什麼區別

膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用於哺乳動細胞的分離。
膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。

『拾』 膠原酶化學溶解術怎麼樣

膠原酶化學溶解術，是有很多優點的：

1. 可以達到根治椎間盤突出所致疾病的目的。膠原酶具有特異溶解性，可以溶解突出的椎間盤組織，解除其對神經根和脊髓的壓迫。術後注意休息和康復鍛煉，一般不易復發。

2. 安全性高。在CT引導下准確進入注射部位，不損傷神經、血管等重要結構。

3. 創傷小，痛苦小。不損傷骨質和韌帶，保持了脊柱的完整性。操作中無痛苦。

4. 費用低廉，住院時間短。一般情況下，5～9天可以出院，減輕了患者的經濟負擔。

膠原酶化學溶解術，亦稱膠原酶溶核術是在C型臂X線機、CT引導下，將膠原酶准確地注射到突出的椎間盤內及其周圍，使突出的椎間盤溶解並吸收，解除其對神經根的壓迫，達到與手術摘除椎間盤突出物同樣的效果。優良率可達90％以上。由於該治療方法創傷小，並發症少，療效可靠，已成為治療椎間盤突出所致的頸椎病、腰椎間盤突出症有效的微創介入治療方法之一。

治療原理

1. 膠原酶溶解術是將膠原酶注入病變的椎間盤內或突出物的周圍，依靠膠原酶分解膠原纖維的葯理作用來溶解膠原組織，使突出物減小或消失，以緩解或消除其對神經組織的壓迫，從而使患者的臨床症狀得到改善。膠原酶是一種主要溶解膠原蛋白的酶，能有效地溶解髓核和纖維環中的Ⅰ型和Ⅱ型膠原，與人體組織滲透壓相等的膠原酶溶液不破壞組織細胞和神經細胞，對血紅蛋白、乳酪蛋白、硫酸角質素等蛋白無損害，能在正常的生理環境和酸鹼度下分解膠原纖維，使其降解為相關的氨基酸並被血漿所吸收。

2. 將膠原酶注入病變的椎間盤內或突出物的周圍，依靠膠原酶分解膠原纖維的葯理作用來溶解膠原組織，使突出物減小或消失，以緩解或消除其對神經組織的壓迫，從而使患者的臨床症狀得到改善，這種治療方法稱為膠原酶溶解術。

3. 椎間盤髓核組織主要由粘多糖、膠原蛋白構成，瑞典學者Carl Hirsch於1959年進行了木瓜凝乳蛋白酶，則無應用抗生素的必要。倘若在X線室及無消毒條件的CT室進行操作，患者體質情況又較差時，治療後應當應用抗生素1周。因為一旦椎間隙發生感染或發生硬膜外腔感染，處理上較為棘手。預防的方法是在嚴格無菌環境下進行操作。