膠原酶消化到什麼程度

⑴ 我想查一下膠原酶的作用

膠原酶是人體內源性膠原酶是指人體內部本身所，具有的膠原酶如牙齦、觸膜等上皮組織和關節滑膜、椎間盤內都不同程度的存在著這種膠原酶它在體內膠原蛋白的分解過程中發揮著不可或缺的作用。要補充膠原酶只要一點點輔助作用對腰間盤明顯根本沒有什麼效果的

⑵ 幹細胞消化傳代要注意哪些問題

一、貼壁細胞的消化 :
常用的消化方法主要有酶消化法、離子螯合劑、物理法和冷凍法。其中最常用的是酶消化法。
1、 酶消化法
貼壁幹細胞酶消化傳代時通常採用兩種方式：1）、加入胰酶等幹細胞脫落後，再加培養基中止胰酶作用，離心傳代；2）、加入胰酶後，鏡下觀察待幹細胞開始脫落時，棄去胰酶，加入培養液並分瓶。但前者太麻煩，而後者有可能對幹細胞施加胰酶選擇，因為總是貼壁不牢的幹細胞先脫落。
常用的消化酶有:
1）、胰酶 這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據幹細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鍾到幾十分鍾不等。0.25%的胰酶作用於單層貼壁的幹細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鍾就足夠了。終止是用血清。主要作用於幹細胞間。配製時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存於-20度。
2）、膠原酶 這種方法比較少，一般是用原代培養時，從組織消化下幹細胞。這種方法作用溫和，對幹細胞損傷較小，但是，價格也較貴。中止同樣是用血清。

胰酶的質量是影響幹細胞的消化的關鍵因素之一，如果配的比較標准，消化的時候就容易消化，反之就不易消化。還要在你看到消化過頭的情況下，如果幹細胞下來的比較多了，這時可以連同CMF或PBS加上營養液一起傳。營養液中有血清，胰酶遇到血清就會自動終止消化，但這樣操作對幹細胞是有一定的影響的。
對於容易消化的幹細胞，加入PBS緩沖液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s（根據細胞消化的難易程度），棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將幹細胞消化單細胞。

在此介紹一種簡單省事並且效果好、不損失幹細胞的方法：倒掉舊培養液，加入少量胰酶沖洗一下，倒掉，再加入0.125-0.25%胰酶約6-10滴或1ml（25ml bottle）消化，再加入適量新培養基中和並分瓶。

這里，胰酶消化的程度是一個關鍵：消化過度則對幹細胞的活性損傷較大，並有部分幹細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足則幹細胞難於從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷幹細胞活性。 影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配製條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復凍融、化凍後存放時間及溫度等）、消化時的溫度（氣溫、細胞培養瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等 。
2、離子螯合劑
離子螯合劑：不破壞細胞表面分子，僅與CAMs螯合，因此，如果檢測幹細胞表面分子的話，盡量，甚至是一定不要用酶消化法。
1）、EDTA 用得也是非常多。一般濃度在0.02%左右。作用於細胞與間質，對細胞間也有一定作用。注意，它能顯著影響pH值，而且在弱鹼性條件下才易溶。因此，配製時應調節好酸鹼度，它不能被中和。因此，消化下來的幹細胞要洗一遍。
2）、商品化的無酶消化液 有些消化酶液對幹細胞的損傷比較大，但是分離成單細胞懸液的能力確實比較強。

對於較難消化的幹細胞，可以用2%利多卡因消化5-8分鍾，然後再棄去，加培養基吹打。或者是棄去培養液後，用0.04%的EDTA沖洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室溫孵育5min，棄去大部分EDTA，加入與剩餘EDTA等量的胰酶（預熱）總體積1/10v。消化到有幹細胞脫落。但大量使用EDTA對幹細胞有損傷作用。也可以先用PBS把幹細胞洗兩遍，使瓶內沒有血清了，減少對胰酶的中和，然後用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然後可以在少量幹細胞消化下來時，拿著瓶口，運用手腕的力量輕輕震盪瓶內液體，這樣幹細胞很快就下來了，還不需要吹打，分散也均勻。
3、物理法：直接吹打或用細胞刮子將幹細胞刮下來。
4、冷凍法：
此方法僅能用於細胞傳代時無法使組織上的細胞脫落下來的情況。本方法的原理是因幹細胞冷凍後收縮，從而從培養瓶上脫落下來。優點是：對幹細胞損傷小，不需要中止或洗幹細胞，方便，不需要另外配製消化液。特別適用那些貼壁不是特別緊，又特別嬌氣的幹細胞。不足是幹細胞常成小片脫落。此種方法曾用於因用其它方法傳代導致大量細胞死亡操作的間充質幹細胞、DC細胞的培養，效果非常滿意。具體過程是：1）、用較多的4度的PBS洗滌一遍細胞(以6孔板為例，加1.5ml/孔)，2）、再加0.5ml 4度的PBS，靜置操作台上，很快細胞就小片脫落，3）、輕輕吹打，細胞即完全脫落，4）、按一定比例傳代。
消化時間和幹細胞類型、消化液的消化能力、幹細胞的密度等多種因素有關。幹細胞消化過程要注意消化時間。一般養一種新的幹細胞要摸索一下消化時間，掌握幹細胞消化到什麼程度恰到好處。新配的消化液消化能力較強，配好後可分裝成小管，一次用完，其餘凍在－20℃，以保持酶活力。消化液只需鋪滿瓶底即可，可放入培養箱中，因外在37℃時酶的活力高於常溫，有利於縮短消化時間。還有一種方法，就是將胰酶鋪滿瓶底後，輕搖培養瓶，使胰酶與幹細胞充分解除，然後倒掉大部分胰酶，利用剩餘的少量胰酶再消化一段時間，待幹細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可。細胞生長到覆蓋70～80％瓶底時消化較好，若幹細胞密度過大則消化後幹細胞易成團。

消化時間不應超過5分鍾，否則對幹細胞損害很大。消化液覆蓋幹細胞，成一薄膜，然後反復傾斜，使消化液沖刷幹細胞，當幹細胞收縮，部分幹細胞脫落時，可用完全培養基馬上中和，同時吹打壁上幹細胞。
在消化過程中經常出現細胞鋪不開的問題，原因有二：一是消化時離心管中的細胞沒有吹打開，解決方法是離心後的細胞加3ml左右的培養基，用吸管輕輕吹打，吹打開後，再加培養基，這樣細胞不會成團，培養基太多，細胞不容易吹打開。二是接種時，培養瓶中先加培養基，再接種細胞，接種後輕輕晃動搖勻。先加細胞後加培養基或不晃動搖勻，其結果就是細胞鋪不開。

二、 貼壁幹細胞的傳代擴增
貼壁幹細胞在培養瓶長成緻密單層後，繼續生長的空間不足，培養基中的營養成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養，對幹細胞進行傳代擴增。
對於貼壁不太緊的細胞，可以直接吹散後分瓶。而對於貼壁較緊的幹細胞如CHO，則需要以胰酶消化後再吹散分瓶，一般過程為：
• 將長成緻密單層幹細胞的細胞瓶中原來的培養液棄去；
• 加入0.25％胰酶溶液，視細胞瓶的大小加入體積為0.5ml或更多，以使充分浸潤；
• 一般消化時間約為1至3分鍾，肉眼觀察瓶壁半透明的細胞層，當見到出現細針孔空隙時，棄去胰酶溶液，並加入適量的細胞培養液終止消化；
• 視實驗要求分入多瓶繼續培養，一般為一傳二到一傳四的比例。

傳代細胞培養注意事項：
1.嚴格的無菌操作 .
2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配製時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養幹細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變鬆散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

⑶ 什麼是膠原酶消化法

就是用膠原酶處理消化組織達到分離細胞的目的，所用膠原酶有不同類型：
1、膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細胞，用於哺乳動細胞的分離。
2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。
3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用於胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞。
4、膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織

⑷ 膠原酶的使用

1.將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm3左右小塊
2.將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。
3.將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內，每隔3min振搖一次，如能放在37℃的恆溫震盪水浴箱中則更好。
消化時間與組織的類別很有關系，對於某些腫瘤組織或其他較緻密結締組織，消化時間4~48h，對於容易消化的組織可以採用37℃震盪消化15~45min，也可以根據具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經膠原酶消化後，由於上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。
4.收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用100目不銹鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者無血清培養液離心漂洗1~2次，去除上清，加培養液製成細胞懸液，接種培養瓶。

⑸ 膠原酶對肌肉是否有溶解作用

有，它具有獨特的消化天然膠原和變性膠原的能力。由於對壞死組織有較強的消化作用，故可促進上皮細胞生長，加快創口癒合而不影響人體正常神經血管和肌肉組織。外用油膏用於Ⅱ度灼傷的清創、脫痂和減少疤痕增生、慢性潰瘍、褥瘡等，有效率達84.5％，不過你的情況沒說清楚，很難斷定啊，建議去醫生那裡咨詢一下
麻煩採納，謝謝!

⑹ Collagenase D是否就是Collagenase IV

膠原酶的化學名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構，而不損傷其它蛋白質和組織。膠原酶的化學本質是一種蛋白質，因此，這對溫度、PH和導致蛋白質變性的各種因素均非常敏感，極易受到外界條件的影響而改變其本身的構象和性質。 膠原酶按其存在的方式不同可分為人體內源性膠原酶和葯用膠原酶兩種。人體內源性膠原酶是指人體內部本身所具有的膠原酶，如牙齦、觸膜等上皮組織和關節滑膜、椎間盤內都不同程度的存在著這種膠原酶，它在體內膠原蛋白的分解過程中發揮著不可或缺的作用。葯用膠原酶是指利用生物制葯的高科技手段從溶組織梭狀芽孢桿菌的發酵液中提取、純化並精製而得的白色或類白色無菌凍乾粉針生物制劑。 膠原酶（collagenase）是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結締組織中膠原蛋白成分。當擬消化的組織較硬，內含較多結締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細胞的效果較差，這時可採用膠原酶解離細胞法。 膠原酶僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。因此適於消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%。膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶，要根據所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。 1、膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用於哺乳動細胞的分離。 2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。 3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用於胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞。 4、膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。 膠原酶的配置 膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。 注意： 因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。 鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。 膠原酶的使用 1.將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm3左右小塊 2.將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。 3.將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內，每隔3min振搖一次，如能放在37℃的恆溫震盪水浴箱中則更好。 消化時間與組織的類別很有關系，對於某些腫瘤組織或其他較緻密結締組織，消化時間4~48h，對於容易消化的組織可以採用37℃震盪消化15~45min，也可以根據具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經膠原酶消化後，由於上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。 4.收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用100目不銹鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者無血清培養液離心漂洗1~2次，去除上清，加培養液製成細胞懸液，接種培養瓶。

⑺ 細胞培養傳代時終止消化用什麼試劑

細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好
一、貼壁細胞的消化
:
常用的消化方法主要有酶消化法、離子螯合劑、物理法和冷凍法。其中最常用的是酶消化法。
1、
酶消化法
貼壁幹細胞酶消化傳代時通常採用兩種方式：1）、加入胰酶等幹細胞脫落後，再加培養基中止胰酶作用，離心傳代；2）、加入胰酶後，鏡下觀察待幹細胞開始脫落時，棄去胰酶，加入培養液並分瓶。但前者太麻煩，而後者有可能對幹細胞施加胰酶選擇，因為總是貼壁不牢的幹細胞先脫落。
常用的消化酶有:
1）、胰酶
這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據幹細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鍾到幾十分鍾不等。0.25%的胰酶作用於單層貼壁的幹細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鍾就足夠了。終止是用血清。主要作用於幹細胞間。配製時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存於-20度。
2）、膠原酶
這種方法比較少，一般是用原代培養時，從組織消化下幹細胞。這種方法作用溫和，對幹細胞損傷較小，但是，價格也較貴。中止同樣是用血清。
胰酶的質量是影響幹細胞的消化的關鍵因素之一，如果配的比較標准，消化的時候就容易消化，反之就不易消化。還要在你看到消化過頭的情況下，如果幹細胞下來的比較多了，這時可以連同cmf或pbs加上營養液一起傳。營養液中有血清，胰酶遇到血清就會自動終止消化，但這樣操作對幹細胞是有一定的影響的。
對於容易消化的幹細胞，加入pbs緩沖液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s（根據細胞消化的難易程度），棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將幹細胞消化單細胞。

⑻ 膠原酶和胰酶在細胞原代培養中的區別

膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用，作用對象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。消化原代培養的上皮類細胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應用的消化劑.胰蛋白酶是一種胰臟製品,對蛋白質有水介作用,主要作用於賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開,在常用的蛋白酶中由於產品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的作用,取決於細胞類型、酶的活力、配製的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等.

膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶,對膠原有很強的消化作用.適於消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細胞間質有較好的消化作用,對細胞本身影響不大,可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害.該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養液配製,即操作簡便又可提高細胞成活率,最終濃度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無需機械振盪,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本.

⑼ 膠原酶在4度冰箱放了一個月會失活嗎

膠原酶4度存放，最好1~2周內用完；
長時間貯存宜在-20攝氏度，用前可放37度溶解，但溶解時間不能過久，防止酶活性受影響；
消化組織時間：取決於消化液濃度和組織類型，一般消化時間為2－3小時或者4度過夜。

⑽ 細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎

細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好
一、貼壁細胞的消化 :
常用的消化方法主要有酶消化法、離子螯合劑、物理法和冷凍法。其中最常用的是酶消化法。
1、 酶消化法
貼壁幹細胞酶消化傳代時通常採用兩種方式：1）、加入胰酶等幹細胞脫落後，再加培養基中止胰酶作用，離心傳代；2）、加入胰酶後，鏡下觀察待幹細胞開始脫落時，棄去胰酶，加入培養液並分瓶。但前者太麻煩，而後者有可能對幹細胞施加胰酶選擇，因為總是貼壁不牢的幹細胞先脫落。
常用的消化酶有:
1）、胰酶 這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據幹細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鍾到幾十分鍾不等。0.25%的胰酶作用於單層貼壁的幹細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鍾就足夠了。終止是用血清。主要作用於幹細胞間。配製時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存於-20度。
2）、膠原酶 這種方法比較少，一般是用原代培養時，從組織消化下幹細胞。這種方法作用溫和，對幹細胞損傷較小，但是，價格也較貴。中止同樣是用血清。

胰酶的質量是影響幹細胞的消化的關鍵因素之一，如果配的比較標准，消化的時候就容易消化，反之就不易消化。還要在你看到消化過頭的情況下，如果幹細胞下來的比較多了，這時可以連同CMF或PBS加上營養液一起傳。營養液中有血清，胰酶遇到血清就會自動終止消化，但這樣操作對幹細胞是有一定的影響的。
對於容易消化的幹細胞，加入PBS緩沖液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s（根據細胞消化的難易程度），棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將幹細胞消化單細胞。