為什麼血清不能終止膠原酶

㈠ 幹細胞消化傳代要注意哪些問題

一、貼壁細胞的消化 :
常用的消化方法主要有酶消化法、離子螯合劑、物理法和冷凍法。其中最常用的是酶消化法。
1、 酶消化法
貼壁幹細胞酶消化傳代時通常採用兩種方式：1）、加入胰酶等幹細胞脫落後，再加培養基中止胰酶作用，離心傳代；2）、加入胰酶後，鏡下觀察待幹細胞開始脫落時，棄去胰酶，加入培養液並分瓶。但前者太麻煩，而後者有可能對幹細胞施加胰酶選擇，因為總是貼壁不牢的幹細胞先脫落。
常用的消化酶有:
1）、胰酶 這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據幹細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鍾到幾十分鍾不等。0.25%的胰酶作用於單層貼壁的幹細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鍾就足夠了。終止是用血清。主要作用於幹細胞間。配製時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存於-20度。
2）、膠原酶 這種方法比較少，一般是用原代培養時，從組織消化下幹細胞。這種方法作用溫和，對幹細胞損傷較小，但是，價格也較貴。中止同樣是用血清。

胰酶的質量是影響幹細胞的消化的關鍵因素之一，如果配的比較標准，消化的時候就容易消化，反之就不易消化。還要在你看到消化過頭的情況下，如果幹細胞下來的比較多了，這時可以連同CMF或PBS加上營養液一起傳。營養液中有血清，胰酶遇到血清就會自動終止消化，但這樣操作對幹細胞是有一定的影響的。
對於容易消化的幹細胞，加入PBS緩沖液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s（根據細胞消化的難易程度），棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將幹細胞消化單細胞。

在此介紹一種簡單省事並且效果好、不損失幹細胞的方法：倒掉舊培養液，加入少量胰酶沖洗一下，倒掉，再加入0.125-0.25%胰酶約6-10滴或1ml（25ml bottle）消化，再加入適量新培養基中和並分瓶。

這里，胰酶消化的程度是一個關鍵：消化過度則對幹細胞的活性損傷較大，並有部分幹細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足則幹細胞難於從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷幹細胞活性。 影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配製條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復凍融、化凍後存放時間及溫度等）、消化時的溫度（氣溫、細胞培養瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等 。
2、離子螯合劑
離子螯合劑：不破壞細胞表面分子，僅與CAMs螯合，因此，如果檢測幹細胞表面分子的話，盡量，甚至是一定不要用酶消化法。
1）、EDTA 用得也是非常多。一般濃度在0.02%左右。作用於細胞與間質，對細胞間也有一定作用。注意，它能顯著影響pH值，而且在弱鹼性條件下才易溶。因此，配製時應調節好酸鹼度，它不能被中和。因此，消化下來的幹細胞要洗一遍。
2）、商品化的無酶消化液 有些消化酶液對幹細胞的損傷比較大，但是分離成單細胞懸液的能力確實比較強。

對於較難消化的幹細胞，可以用2%利多卡因消化5-8分鍾，然後再棄去，加培養基吹打。或者是棄去培養液後，用0.04%的EDTA沖洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室溫孵育5min，棄去大部分EDTA，加入與剩餘EDTA等量的胰酶（預熱）總體積1/10v。消化到有幹細胞脫落。但大量使用EDTA對幹細胞有損傷作用。也可以先用PBS把幹細胞洗兩遍，使瓶內沒有血清了，減少對胰酶的中和，然後用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然後可以在少量幹細胞消化下來時，拿著瓶口，運用手腕的力量輕輕震盪瓶內液體，這樣幹細胞很快就下來了，還不需要吹打，分散也均勻。
3、物理法：直接吹打或用細胞刮子將幹細胞刮下來。
4、冷凍法：
此方法僅能用於細胞傳代時無法使組織上的細胞脫落下來的情況。本方法的原理是因幹細胞冷凍後收縮，從而從培養瓶上脫落下來。優點是：對幹細胞損傷小，不需要中止或洗幹細胞，方便，不需要另外配製消化液。特別適用那些貼壁不是特別緊，又特別嬌氣的幹細胞。不足是幹細胞常成小片脫落。此種方法曾用於因用其它方法傳代導致大量細胞死亡操作的間充質幹細胞、DC細胞的培養，效果非常滿意。具體過程是：1）、用較多的4度的PBS洗滌一遍細胞(以6孔板為例，加1.5ml/孔)，2）、再加0.5ml 4度的PBS，靜置操作台上，很快細胞就小片脫落，3）、輕輕吹打，細胞即完全脫落，4）、按一定比例傳代。
消化時間和幹細胞類型、消化液的消化能力、幹細胞的密度等多種因素有關。幹細胞消化過程要注意消化時間。一般養一種新的幹細胞要摸索一下消化時間，掌握幹細胞消化到什麼程度恰到好處。新配的消化液消化能力較強，配好後可分裝成小管，一次用完，其餘凍在－20℃，以保持酶活力。消化液只需鋪滿瓶底即可，可放入培養箱中，因外在37℃時酶的活力高於常溫，有利於縮短消化時間。還有一種方法，就是將胰酶鋪滿瓶底後，輕搖培養瓶，使胰酶與幹細胞充分解除，然後倒掉大部分胰酶，利用剩餘的少量胰酶再消化一段時間，待幹細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可。細胞生長到覆蓋70～80％瓶底時消化較好，若幹細胞密度過大則消化後幹細胞易成團。

消化時間不應超過5分鍾，否則對幹細胞損害很大。消化液覆蓋幹細胞，成一薄膜，然後反復傾斜，使消化液沖刷幹細胞，當幹細胞收縮，部分幹細胞脫落時，可用完全培養基馬上中和，同時吹打壁上幹細胞。
在消化過程中經常出現細胞鋪不開的問題，原因有二：一是消化時離心管中的細胞沒有吹打開，解決方法是離心後的細胞加3ml左右的培養基，用吸管輕輕吹打，吹打開後，再加培養基，這樣細胞不會成團，培養基太多，細胞不容易吹打開。二是接種時，培養瓶中先加培養基，再接種細胞，接種後輕輕晃動搖勻。先加細胞後加培養基或不晃動搖勻，其結果就是細胞鋪不開。

二、 貼壁幹細胞的傳代擴增
貼壁幹細胞在培養瓶長成緻密單層後，繼續生長的空間不足，培養基中的營養成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養，對幹細胞進行傳代擴增。
對於貼壁不太緊的細胞，可以直接吹散後分瓶。而對於貼壁較緊的幹細胞如CHO，則需要以胰酶消化後再吹散分瓶，一般過程為：
• 將長成緻密單層幹細胞的細胞瓶中原來的培養液棄去；
• 加入0.25％胰酶溶液，視細胞瓶的大小加入體積為0.5ml或更多，以使充分浸潤；
• 一般消化時間約為1至3分鍾，肉眼觀察瓶壁半透明的細胞層，當見到出現細針孔空隙時，棄去胰酶溶液，並加入適量的細胞培養液終止消化；
• 視實驗要求分入多瓶繼續培養，一般為一傳二到一傳四的比例。

傳代細胞培養注意事項：
1.嚴格的無菌操作 .
2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配製時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養幹細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變鬆散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

㈡ 細胞培養傳代時終止消化用什麼試劑

細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好
一、貼壁細胞的消化
:
常用的消化方法主要有酶消化法、離子螯合劑、物理法和冷凍法。其中最常用的是酶消化法。
1、
酶消化法
貼壁幹細胞酶消化傳代時通常採用兩種方式：1）、加入胰酶等幹細胞脫落後，再加培養基中止胰酶作用，離心傳代；2）、加入胰酶後，鏡下觀察待幹細胞開始脫落時，棄去胰酶，加入培養液並分瓶。但前者太麻煩，而後者有可能對幹細胞施加胰酶選擇，因為總是貼壁不牢的幹細胞先脫落。
常用的消化酶有:
1）、胰酶
這是用得最多的。一般濃度在0.25-0.5%。作用時間根據幹細胞種類、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鍾到幾十分鍾不等。0.25%的胰酶作用於單層貼壁的幹細胞，在37度條件下，一般消化1-5分鍾就足夠了。終止是用血清。主要作用於幹細胞間。配製時不能用含鈣、鎂的平衡液，否則影響活性。保存於-20度。
2）、膠原酶
這種方法比較少，一般是用原代培養時，從組織消化下幹細胞。這種方法作用溫和，對幹細胞損傷較小，但是，價格也較貴。中止同樣是用血清。
胰酶的質量是影響幹細胞的消化的關鍵因素之一，如果配的比較標准，消化的時候就容易消化，反之就不易消化。還要在你看到消化過頭的情況下，如果幹細胞下來的比較多了，這時可以連同cmf或pbs加上營養液一起傳。營養液中有血清，胰酶遇到血清就會自動終止消化，但這樣操作對幹細胞是有一定的影響的。
對於容易消化的幹細胞，加入pbs緩沖液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s（根據細胞消化的難易程度），棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將幹細胞消化單細胞。

㈢ 動物細胞培養中血清的作用和可能引發的問題是什麼

血清主要作用：
●提供基本營養物質：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等,是細胞生長必須的物質.
●提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素（氫化可的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等.生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等.
●提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質,如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等,轉鐵蛋白攜帶鐵.結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用.
●提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷.
●對培養中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞,如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用.這種作用是偶然發現的,現在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用.因為胰蛋白酶已經被廣泛用於貼壁細胞的消化傳代.血清蛋白形成了血清的粘度,可以保護細胞免受機械損傷,特別是在懸浮培養攪拌時,粘度起到重要作用.血清還含有一些微量元素和離子,他們在代謝解毒中起重要作用,如SeO3,硒等.

血清應用於細胞培養中的缺點：
成分不明確,血清保存期短,至多一年.不能排除血清中含有易變物質,使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態.血清可能促進某些細胞的生長(成纖維細胞)同時抑制另一類細胞生長(表皮細胞).血清含一些對細胞產生毒性的物質,影響細胞生長,甚至造成細胞死亡. 取材中可能帶入支原體、病毒,對細胞產生潛在影響可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性. 血清製作過程復雜、批間差異大成分不能保持一致使用使得實驗和生產的標准化困難,其中的蛋白質使得某些轉基因蛋白生物葯品生產中分離純化工作很難完成.

㈣ 去除纖維細胞後如何終止膠原酶消化

加點代血清的培養基。

㈤ 肝細胞培養

㈥ 膠原酶的配置

膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。
注意：
因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。
鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。

㈦ 為什麼動物細胞的培養要加入血清

天然培養基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養技術建立早期，體外培養細胞都是利用天然培養基。但是由於天然培養基製作過程復雜，因此逐漸為合成培養基所替代。目前廣泛使用的天然培養基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養某些特殊細胞也是必不可少。
血清細胞培養的發展，培養基的質量又是關鍵，而培養基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應用中牛血清又是最為廣泛的，所以血清是醫葯生物技術產品中重要的原材料之一。保證血清質量也是促進生物製品質量提高的重要環節。1．血清種類
目前用於組織培養的血清主要是牛血清，培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養細胞的原因：來源充足、制備技術成熟、經過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數哺乳動物細胞都是適合的，但並不排除在培養某種細胞時使用其他動物血清更合適。
牛血清是細胞培養中用量最大的天然培養基，含有豐富的細胞生長必須的營養成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產的胎牛；新牛血清取自出生24小時之內的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質最高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。2．血清的主要成分
血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。對血清的成分和作用的研究雖有很大進展，但仍存在一些問題。主要是：第一：血清的成份可能有幾百種之多，目前對其准確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難。第二：血清都是批量生產，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標准化和連續性受到限制。第三：不能排除血清中含有易變物質，這被認為是「瓶中惡化」的原因之一。3．血清主要作用
提供基本營養物質：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質。
提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素（氫化可的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。
提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。
提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。
對培養中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞，如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發現的，現在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經被廣泛用於貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,
硒等。4．細胞培養中使用血清的缺點
血清成分復雜，雖含許多對細胞有利成分，也含有對細胞有害的成分，使血清有幾個明顯的缺點：
對大多數細胞，在體內狀態，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷癒合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）。
血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。
動物個體不同，血清產地、批號不同，每批質量差異甚大，其成分不能保持一致。
取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響，可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性。
血清的使用使得實驗和生產的標准化困難，其中的蛋白質使得某些轉基因蛋白生物葯品生產中分離純化工作很難完成。
大規模生產中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構成動物細胞培養對生產成本的主要部分之一。

㈧ 為什麼動物細胞的培養要加入血清

天然培養基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基,如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等.組織培養技術建立早期,體外培養細胞都是利用天然培養基.但是由於天然培養基製作過程復雜,因此逐漸為合成培養基所替代.目前廣泛使用的天然培養基是血清,另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養某些特殊細胞也是必不可少.
血清細胞培養的發展,培養基的質量又是關鍵,而培養基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發揮著重要甚至是難以替代的作用.在動物血清的應用中牛血清又是最為廣泛的,所以血清是醫葯生物技術產品中重要的原材料之一.保證血清質量也是促進生物製品質量提高的重要環節.1．血清種類
目前用於組織培養的血清主要是牛血清,培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等.選擇用牛血清培養細胞的原因：來源充足、制備技術成熟、經過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解.牛血清對絕大多數哺乳動物細胞都是適合的,但並不排除在培養某種細胞時使用其他動物血清更合適.
牛血清是細胞培養中用量最大的天然培養基,含有豐富的細胞生長必須的營養成份,具有極為重要的功能.牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清.胎牛血清應取自剖腹產的胎牛；新牛血清取自出生24小時之內的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛.顯然,胎牛血清是品質最高的,因為胎牛還未接觸外界,血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少.2．血清的主要成分
血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物,其組成成份雖大部分已知,但還有一部分尚不清楚,且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異.血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等,這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的.對血清的成分和作用的研究雖有很大進展,但仍存在一些問題.主要是：第一：血清的成份可能有幾百種之多,目前對其准確的成份、含量及其作用機制仍不清楚,尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識,這給研究工作帶來許多困難.第二：血清都是批量生產,各批量之間差異很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保證每批血清的相似性極為困難,從而使實驗的標准化和連續性受到限制.第三：不能排除血清中含有易變物質,這被認為是「瓶中惡化」的原因之一.3．血清主要作用
提供基本營養物質：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等,是細胞生長必須的物質.
提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素（氫化可的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等.生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等.
提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質,如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等,轉鐵蛋白攜帶鐵.結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用.
提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷.
對培養中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞,如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用.這種作用是偶然發現的,現在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用.因為胰蛋白酶已經被廣泛用於貼壁細胞的消化傳代.血清蛋白形成了血清的粘度,可以保護細胞免受機械損傷,特別是在懸浮培養攪拌時,粘度起到重要作用.血清還含有一些微量元素和離子,他們在代謝解毒中起重要作用,如SeO3,
硒等.4．細胞培養中使用血清的缺點
血清成分復雜,雖含許多對細胞有利成分,也含有對細胞有害的成分,使血清有幾個明顯的缺點：
對大多數細胞,在體內狀態,血清不是它們接觸的生理學液體,只是在損傷癒合

㈨ 膠原酶和胰酶在細胞原代培養中的區別

膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用，作用對象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。消化原代培養的上皮類細胞用此酶效果更好。

胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應用的消化劑.胰蛋白酶是一種胰臟製品,對蛋白質有水介作用,主要作用於賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開,在常用的蛋白酶中由於產品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的作用,取決於細胞類型、酶的活力、配製的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等.

膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶,對膠原有很強的消化作用.適於消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細胞間質有較好的消化作用,對細胞本身影響不大,可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害.該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養液配製,即操作簡便又可提高細胞成活率,最終濃度200u/mL或0.0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無需機械振盪,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本.